蛋白質(zhì)組學樣品處理方法研究進展

盧國棟，張克山，劉永杰，尚佑軍，郭建宏，鄭海學，田 宏，劉湘濤

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室國家口蹄疫參考實驗室，甘肅 蘭州 730046）

1994年澳大利亞學者 Wilkins和 Williams等人[1]提出了蛋白質(zhì)組（ Proteome）的概念，隨后蛋白質(zhì)組學[2]應運而生且應用廣泛。蛋白質(zhì)組學研究對象包括動物、植物和微生物，樣品的來源廣泛且復雜。蛋白質(zhì)的表達具有時間和空間的特異性，蛋白質(zhì)數(shù)量可能是其基因數(shù)量的數(shù)十倍甚至百倍以上[3]。所以對蛋白質(zhì)的分析將是后基因組時代面臨的巨大挑戰(zhàn)[4]。1975年O’Farrel等[5]建立的雙向凝膠電泳技術和80年代末 John B.Fenn[6]和 Koichi Tanaka[7]發(fā)明的質(zhì)譜分析方法極大的推動了蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，已成為目前該領域主要的研究技術手段。但雙向凝膠電泳分析和質(zhì)譜鑒定對樣品的溶解度、純度和濃度等要求較高，簡單處理的蛋白質(zhì)樣品無法滿足需要。為了達到有效的蛋白質(zhì)分離、顯色和鑒定，蛋白質(zhì)的前處理至關重要。本文從對疏水性強的蛋白質(zhì)[8]、極性蛋白質(zhì)、高豐度蛋白的處理、低豐度蛋白的富集和對樣品溶液中干擾性物質(zhì)的去除以及對不同染色后質(zhì)譜前處理等方面綜述了蛋白質(zhì)樣品的一般處理方法。

1 雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)樣品處理

雙向凝膠電泳技術伴隨著蛋白質(zhì)組學的起始和發(fā)展，樣品處理是否得當直接影響雙向電泳的效果[9]。樣品處理的目的是破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子之間的相互作用產(chǎn)生獨立的多肽鏈，提高樣品的溶解度，保持蛋白質(zhì)樣品在整個電泳過程中的溶解狀態(tài)，防止蛋白質(zhì)的人為修飾。此外，蛋白質(zhì)樣品處理過程中去除了蛋白酶、核酸、糖類、脂類和鹽類等非蛋白質(zhì)雜質(zhì)，減少了對后期蛋白質(zhì)的分離、顯色和質(zhì)譜鑒定產(chǎn)生的影響。

1.1 不溶性蛋白質(zhì)的處理

天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)溶解度一般較低，蛋白質(zhì)的增溶作用影響著最終結(jié)果并且決定著整個實驗成敗。由于蛋白質(zhì)的異原性和非蛋白類雜質(zhì)的影響，使所有的蛋白質(zhì)同時溶解仍具有很大的挑戰(zhàn)性。對于不同樣品，需要摸索與之最相適應的處理手段。目前增加蛋白質(zhì)溶解性的原理是加入試劑破壞蛋白質(zhì)多聚體內(nèi)部的相互作用力包括二硫鍵、氫鍵、范德華力、離子鍵和疏水鍵等，使蛋白質(zhì)多聚體裂解為單個的多肽而具有強的溶解性，這些試劑包括離液劑（尿素和硫脲），去污劑（CHAPS和 triton-100），還原劑（DTT，TBP）和蛋白酶抑制劑等[10]。

尿素是一種中性的離液劑，濃度為5～9 mol/L的尿素可以有效破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)展開并暴露出可電離的結(jié)構(gòu)群體使之溶解性增強。實驗證明，尿素溶液中加入硫脲會進一步增加一些水溶性蛋白和跨膜蛋白的溶解度[11]，當尿素中加入了2 mol/L的硫脲，尿素的濃度不應該超過5～7 mol/L[12]。但硫脲會阻礙蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合，因此在進行第二向電泳之前應去除該試劑[13]，值得注意的是尿素和硫脲在溫度較高時可分別水解成氰酸鹽和硫氰酸鹽，導致蛋白質(zhì)人為的修飾，所以樣品溫度不要超過37℃，同時尿素緩沖液中加入兩性電解質(zhì)載體可以清除氰酸鹽[10]。目前提高與膜脂質(zhì)形成復合物的膜相關蛋白的溶解度是當今蛋白質(zhì)組學研究中樣品處理的最大挑戰(zhàn)，去污劑對膜蛋白復合物的提取是極其重要的。去污劑分為離子型（SDS）、非離子型（TritonX-100）和兩性離子型（CHAPS和ASB-14），去污劑的濃度范圍一般為1%～4%。離子型去污劑對疏水性蛋白質(zhì)和膜蛋白的增溶作用效果較好，但干擾非變性電泳和等電聚焦，為不影響SDS-PAGE，最好選用兩性離子和非離子去污劑。兩性離子去污劑結(jié)合了其他類型去污劑的優(yōu)點，能夠有效的分解蛋白質(zhì)多聚體，增溶作用更佳[14]。Triton和NP40，十二烷基麥芽苷[15]等非變性的不帶電荷的去污劑是現(xiàn)在蛋白質(zhì)組學廣泛使用的去污劑，能夠保證蛋白質(zhì)的溶解并且不會發(fā)生凝集作用。同時，Taylor和Pfeiffer也發(fā)現(xiàn)非離子N-十二烷基-β-D-麥芽苷和兩性離子 ASB-14能夠比單用CHAPS更有效的溶解髓磷脂蛋白質(zhì)類[16]。另外，烷基磺酸甜菜堿如SB3-10也已得到應用，缺點是它在高濃度的尿素溶液中溶解度很低[17]。研究表明，在等點聚焦過程中，還原劑可極大的增加角蛋白的溶解度，通常應用巰基還原劑（DTT、DTE），濃度一般在20～100mmol/L。DTT具有不和4-乙烯吡啶、丙烯酰胺發(fā)生作用的優(yōu)點而廣泛應用[18]。

在蛋白質(zhì)組學研究中，蛋白酶的存在會使多種蛋白質(zhì)發(fā)生酶解。Rawlings等人研究表明，人類的機體內(nèi)含有700種蛋白酶[19]。所以細胞裂解之后或分離時需加入特定的蛋白酶抑制劑，如:PMSF，AEBSF，EDTA，抑肽素，芐脒等。除此之外，在進行小量蛋白樣品提取時，SDS緩沖液經(jīng)煮沸后加入高pH值的tris堿同樣可以達到抑制蛋白酶的作用[20]。在酸性的預冷的溶液中（比如20%的TCA）和高濃度的尿素溶液中[13]可以將蛋白酶的降解作用降到最小。另有研究表明，熱休克蛋白在體外可以抑制蛋白酶的作用保護蛋白不被酶解[21]。

1.2 可溶性蛋白質(zhì)的前處理

不可溶性蛋白質(zhì)經(jīng)過處理溶解度增加成為可溶性蛋白質(zhì)，但是，樣品中還有很多其它干擾物質(zhì)，如實驗中處理用的緩沖液、鹽類、脂質(zhì)、糖類、核酸和去污劑等都會阻礙蛋白質(zhì)分離，顯色，鑒定等步驟，使數(shù)據(jù)分析復雜化，必需將其除去。

蛋白樣品中的鹽類組分可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀和聚集，在雙向凝膠電泳前應予以除鹽。一般通過超濾，透析，TCA沉淀，凝膠過濾或者有機溶劑和固相萃取等方法經(jīng)行除鹽，另外也可用商品化的試劑盒進行除鹽。Yuan等對上述除鹽方法進行了比較發(fā)現(xiàn)[22]:相比透析法，超濾法的吸附主要發(fā)生在過濾器上，可以減少蛋白量的損失。柱子去鹽法的優(yōu)點是具有蛋白復性的功能?，F(xiàn)已有商業(yè)化微離心過濾裝置用來除去污染物。脂質(zhì)物質(zhì)廣泛存在于生物的機體內(nèi)，并和許多蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物，造成蛋白質(zhì)的溶解度降低，甚至影響等電點和分子量。另外，脂質(zhì)還會影響到去污劑的作用并降低蛋白質(zhì)富集和分離效應。所以在雙向凝膠電泳的樣品前處理中經(jīng)常運用離心過濾裝置或含有CHAPS的樣品緩沖液去除脂質(zhì)，實現(xiàn)蛋白復性和高效率的分離[23]。另外，蛋白質(zhì)樣品中存在的多聚糖和核酸與兩性電解質(zhì)反應并堵塞聚丙烯酰胺膠上的小孔，易發(fā)生蛋白沉淀或者使聚焦時間延長而使雙向電泳膠上出現(xiàn)紋理。在銀染時，會使膠的背景產(chǎn)生拖尾。為了從樣品中除去多聚糖和核酸，TCA、丙酮苯或酚/醋酸銨沉淀法是很有效的方法。當多聚糖含量較高時，可用超速離心法除去。去污劑的去除包括透析，凝膠過濾層析，疏水吸附層析和蛋白沉淀。對于一些臨界膠束濃度高或者聚合數(shù)量少的去污劑，常選用層析法。對樣品中廣譜的去污劑，選用凝膠過濾，但會導致樣品一定程度的稀釋。相對來說，離子交換層析可有效地去除非離子和兩性去污劑。此外，SDS可以用納米級親水相層析或丙酮沉淀去除，在-20℃時效果比室溫要好。對于兩性去污劑的去除，凝膠過濾層析和去污劑親和層析效果相當，略優(yōu)于透析。同樣，SPE（固相萃?。┰谙♂尩牡鞍兹芤褐腥コ鼵HAPS很有效，比標準的透析或凝膠過濾層析有更好的效果。

1.3 高豐度蛋白的去除和低豐度蛋白的富集

高豐度蛋白會影響到低豐度蛋白的聚焦，降低了裝載容量，從而掩蓋了雙向圖譜中一些重要的蛋白位點，丟失了重要的信息；相反，很多低豐度蛋白質(zhì)在生物機體內(nèi)發(fā)揮著非常重要的作用，在蛋白樣品中含量卻很低，所以在電泳前必須進行高豐度蛋白的去處和低豐度蛋白的富集。血漿，血清和腦脊液是很重要的蛋白質(zhì)組研究對象，這些樣品中往往90%的蛋白是高豐度蛋白，如白蛋白，免疫球蛋白等。這些高豐度蛋白影響到分子量相似的低豐度蛋白的檢測[24]。如今，很多公司都開發(fā)出去除高豐度蛋白的試劑盒，如BIO-RAD Aurum Serum Proteinmini Kit試劑盒等。另外，Merrick等[25]在研究肝損傷后血清中蛋白質(zhì)變化的實驗中運用基于蛋白A/G的抗體親和柱成功的去除了血清中高豐度蛋白。

丙酮、TCA、異丙醇、硫酸銨、乙醇、氯仿/甲醇，聚乙烯乙二醇（PEG）或親和層析試劑是常用的蛋白質(zhì)富集試劑。另外，免疫沉淀反應也可以應用到蛋白質(zhì)的富集中，其原理是抗體和抗原結(jié)合反應，能夠選擇性地富集一種或一類具有相似抗原的蛋白質(zhì)[26]。蛋白質(zhì)富集最簡單的方法是超速離心法。亞細胞器的分離是利用該混合物的密度特征通過一系列不同的速度離心，或者用蔗糖/甘露醇梯度分離進行富集[27]，如線粒體，膜蛋白，核蛋白或其它亞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的富集都是通過此種方法實現(xiàn)。Wenkui等人在研究葉酸缺乏引發(fā)的肝臟和腦的病變時也通過密度梯度離心法分離了蛋白質(zhì)樣品[28]。另外，層析分離可根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷，疏水性，大小或特異性來分離純化和富集蛋白質(zhì)。

1.4 極性蛋白質(zhì)的處理

雙向凝膠電泳技術在分離極性蛋白時面臨一定的挑戰(zhàn)[29]，大部分雙向凝膠電泳分離到的蛋白質(zhì)的等電點分布在4～8之間，但是也有一部分蛋白質(zhì)的等電點大于8[30]，而且在有些蛋白質(zhì)組學研究中極性蛋白居多。通過比較再水化上樣和杯上樣兩種上樣方式可以發(fā)現(xiàn)，再水化上樣對寬pH范圍和酸性pH范圍的膠條分離效果好[31]。但是在進行堿性蛋白質(zhì)的分離時再水化上樣卻不再適合，研究表明杯上樣方式能明顯減少蛋白沉淀，提高堿性蛋白的聚焦效果[32]。另外在毛細管電泳分離中發(fā)現(xiàn)，加入10%的異丙醇可以降低EOF（電滲流驅(qū)動）效應達40%，利用這種原理，在再水化液中加入異丙醇可以提高2-DE在堿性區(qū)蛋白質(zhì)的分辨率。此外，由于局部溫度升高會造成凝膠介質(zhì)磨擦力加大，導致蛋白質(zhì)在膠條上沉淀，甘油則能使膠條柔性增加，減低了這種效果，也使聚焦效果更好[33]。另外，等電聚焦過程中，再水化液中提高DTT濃度和IPG緩沖液的濃度能增加蛋白的溶解性[34]。實驗表明，將再水化液中DTT的濃度由常規(guī)的0.2%提高到2.5%，IPG緩沖液濃度由0.5%提高到2%，可提高pH6～9膠條堿性端蛋白的聚焦效果。

2 質(zhì)譜鑒定前蛋白質(zhì)樣品處理

膠內(nèi)蛋白點（帶）在進行質(zhì)譜鑒定前需先脫色。銀染脫色一般使用30mmol/L鐵氰化鉀與100mmol/L硫代硫酸鈉等比例混合溶液；考染脫色一般使用含50mmol/L碳酸氫銨的50%乙腈水溶液。膠內(nèi)蛋白質(zhì)處于變性狀態(tài)，在質(zhì)譜鑒定前需還原蛋白質(zhì)。試驗證明，經(jīng)含10mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的100mmol/L碳酸氫銨溶液處理后可較好的還原蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)還原后還需經(jīng)過幾步處理包括:含有55mmol/L碘乙酰胺（IAA）的100mmol/L碳酸氫銨溶液暗處處理30min；100mmol/L的碳酸氫銨溶液，室溫處理15min；100%ACN室溫震蕩5min后吸去，凍干；凍干后加入Trypsin溶液，置于4℃30～60min，使膠塊充分吸脹，移走過量的胰酶溶液；再加入50mmol/L的碳酸氫銨溶液，使膠塊在酶解過程中保持浸潤；吸出酶解緩沖液，加入含有0.1%TFA的60%乙腈水溶液，超聲15min，吸出溶液并入前次溶液，重復一次，溶液凍干。

3 展望

綜上所述，蛋白質(zhì)組學樣品處理可從兩方面分析，一是雙向凝膠電泳蛋白樣品處理；二是質(zhì)譜蛋白樣品處理。雙向凝膠電泳主要進行可溶性蛋白的分離[35]，所以處理方法的改進可以提高樣品的溶解度，去除非蛋白類雜質(zhì)的干擾，最大程度還原樣品的真實狀態(tài)，增加試驗結(jié)果的可靠性。質(zhì)譜技術用于鑒定蛋白樣品，對蛋白質(zhì)的純度要求較高[36]，樣品處理后可達到鑒定的敏感性和可靠性。

由于蛋白質(zhì)數(shù)量多、化學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)各異、樣品組分復雜，經(jīng)過近30多年的發(fā)展蛋白質(zhì)組學仍處于初級階段，樣品處理至今沒有統(tǒng)一的標準[13]。一些特殊蛋白質(zhì)，如膜蛋白，極性蛋白，高分子量和低分子量蛋白等還有待進一步的研究。此外，細胞器內(nèi)蛋白質(zhì)、磷脂肽、糖化蛋白等與信號通路相關的蛋白質(zhì)[37]，將會成為研究的熱點，勢必會對蛋白質(zhì)組學樣品處理技術提出新挑戰(zhàn)。隨著蛋白質(zhì)組學樣品處理技術的突破性發(fā)展，將會推動雙向凝膠電泳分離技術和質(zhì)譜鑒定技術在蛋白質(zhì)組學中發(fā)揮更顯著的作用。

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