肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

平偉 付向?qū)?/p>

肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中居首位，腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell, CTC）在肺癌的血行轉(zhuǎn)移中具有極其重要的作用。臨床研究[1-5]顯示CTC與肺癌臨床分期有關(guān)，在肺癌的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估及個(gè)體化治療中具有重要的臨床意義。

1 肺癌CTC概述

肺癌是一種全身性疾病，其發(fā)病率正逐年上升，全球每年死于肺癌的人數(shù)大約有110萬(wàn)。很多患者確診時(shí)已為晚期，錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)期，此外無(wú)法耐受放療或化療及化療后耐藥等原因?qū)е路伟?年生存率不到15%。I期經(jīng)手術(shù)根治性治療的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）仍有超過(guò)30%患者在5年內(nèi)復(fù)發(fā)[6]，且復(fù)發(fā)部位多為全身性轉(zhuǎn)移，提示現(xiàn)有臨床分期的早期就可能已有肺癌微轉(zhuǎn)移的發(fā)生[7]。血行播散是肺癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)血液循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，因此對(duì)肺癌CTC的檢測(cè)研究受到越來(lái)越多的重視。

CTC目前定義為自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[8]。源于肺癌實(shí)體瘤的腫瘤細(xì)胞不斷增殖，通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT）等過(guò)程在分子轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)修飾和細(xì)胞表型上的改變而變得具有侵襲性，從而利于逃離組織束縛進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，成為具有侵襲轉(zhuǎn)移能力的CTC[9]。研究[1-5]發(fā)現(xiàn)檢測(cè)肺癌CTC有助于早期診斷及判斷患者預(yù)后，與臨床分期有關(guān)，在治療期間定期檢測(cè)并監(jiān)測(cè)CTC的變化，可為評(píng)價(jià)治療方案的敏感性提供依據(jù)，有利于開(kāi)展個(gè)體化的治療。

2 肺癌CTC的檢測(cè)

現(xiàn)有分離、檢測(cè)肺癌CTC的技術(shù)方法較多且各有利弊。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）及其各種改進(jìn)技術(shù)目前在肺癌CTC的檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛。RT-PCR檢測(cè)CTC是在PCR的基礎(chǔ)上擴(kuò)增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片段，從而識(shí)別組織或腫瘤特異性mRNA的表達(dá)或某些基因改變后RNA水平的異常。由于這些特異性mRNA半衰期較短，在細(xì)胞死亡后會(huì)被RNA酶迅速降解，且通常不表達(dá)于正常外周血細(xì)胞中，所以在肺癌患者外周血中檢測(cè)到特異性mRNA可間接提示CTC的存在[10]。近些年新開(kāi)發(fā)的熒光定量RT-PCR、巢式RT-PCR及實(shí)時(shí)定量RTPCR，雖提高了檢測(cè)的敏感性和特異性，但仍存在CTC計(jì)數(shù)障礙[11]，而Cell Search System[12]和CTC-chip[3]等新技術(shù)的應(yīng)用，可進(jìn)行肺癌CTC計(jì)數(shù)，便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，且不影響細(xì)胞活性，有利于下一步的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)分析。

Cell Search System是基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法，CTC用EpCAM抗體磁珠進(jìn)行富集后，在一個(gè)外加強(qiáng)力磁場(chǎng)的作用下可從血液中被提取，對(duì)分離出來(lái)的CTC進(jìn)行通透、固定，用DAPI熒光核染料、CD45熒光抗體和CK8、CK18以及CK19熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞，然后采用半自動(dòng)四色熒光顯微鏡Cell-Spotter Analyzer檢測(cè)分析，符合腫瘤細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征并且CK-PE+、DAPI+和CD45-的細(xì)胞被定義為CTC。此系統(tǒng)能從7.5 mL的全血中檢測(cè)到單一的腫瘤細(xì)胞。CTC-chip是近年來(lái)新出現(xiàn)的一種基于微流體學(xué)的檢測(cè)技術(shù)。它在一張與標(biāo)準(zhǔn)載玻片尺寸相同的硅片上面覆蓋8萬(wàn)個(gè)顯微位點(diǎn)，每一個(gè)位點(diǎn)都包被上能夠捕捉CTC的抗體。當(dāng)血液樣品通過(guò)微流芯片時(shí)，這些位點(diǎn)叢即可確保CTC在流過(guò)芯片前被捕獲。

3 肺癌CTC與早期診斷

肺癌的早期診斷對(duì)治療效果至關(guān)重要，早期發(fā)現(xiàn)及時(shí)治療是提高生存率的關(guān)鍵。研究[2,13]顯示CTC對(duì)肺癌早期診斷具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，在無(wú)明顯臨床癥狀和轉(zhuǎn)移灶的I期患者體內(nèi)也可檢測(cè)到CTC，說(shuō)明現(xiàn)有臨床分期的早期就已存在肺癌細(xì)胞的播散[7]，并能在大量聚集后形成具有高度轉(zhuǎn)移潛能的循環(huán)腫瘤微栓（circulating tumor microemboli, CTM）。理論上使用基于腫瘤細(xì)胞大小的分離法（isolation by size of epithelial tumor cells, ISET）可對(duì)CTM進(jìn)行富集[11]，這使未來(lái)對(duì)高?；颊咴缙诤Y查協(xié)助診治成為可能。且目前已有學(xué)者借助于CTC對(duì)轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）早期做出診斷，Bevilacqua等[2]最初對(duì)1例患者肺組織穿刺活檢診斷為低分化神經(jīng)內(nèi)分泌瘤，但應(yīng)用Cell Search System在外周血中檢測(cè)到EpCAM和CK陽(yáng)性的CTC，然而EpCAM通常不表達(dá)于低分化神經(jīng)內(nèi)分泌瘤，其后對(duì)肝臟穿刺活檢發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)肺轉(zhuǎn)移灶，最后確診為EpCAM和CK陽(yáng)性的SCLC。與目前的影像學(xué)、腫瘤標(biāo)志物等相比，CTC在肺癌的早期診斷應(yīng)用中尚處于起步階段，檢測(cè)CTC能否作為早期診斷的指標(biāo)，還需進(jìn)一步探討，但聯(lián)合多項(xiàng)檢查后的綜合判斷會(huì)提高臨床醫(yī)師診療的警惕性。

4 肺癌CTC與臨床分期

目前臨床上廣泛使用的肺癌分期方法仍以解剖學(xué)特征為基礎(chǔ)，但隨著分子機(jī)制在腫瘤生物學(xué)上的發(fā)展，近年來(lái)已有不少學(xué)者提出分子分期的概念[12]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)直徑≤1 cm的腫瘤就已發(fā)生轉(zhuǎn)移，無(wú)臨床轉(zhuǎn)移病灶的I期肺癌中也可檢測(cè)到CTC[7]。雖然血液中檢測(cè)到CTC并不意味著一定存在轉(zhuǎn)移灶，但研究[1,7,14]顯示肺癌CTC與腫瘤分期具有明顯的相關(guān)性。Kurusu等[7]應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)103例手術(shù)治療的NSCLC患者外周血中的腫瘤組織特異性CEA mRNA，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率很大程度上與術(shù)前術(shù)后的臨床分期有關(guān)。Yie等[14]應(yīng)用RT-PCR ELISA對(duì)143例NSCLC患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)Survivin mRNA的CTC與腫瘤侵犯程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)。Sher等[1]在其研究中也發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者CTC陽(yáng)性率明顯高于早期患者，且CTC可作為T(mén)NM分期系統(tǒng)的有益補(bǔ)充。雖然尚不能將CTC迅速應(yīng)用于仍以解剖學(xué)特征為基礎(chǔ)的肺癌分期系統(tǒng)，但以上研究提示CTC有潛力協(xié)助分期，結(jié)合影像學(xué)或病理學(xué)的檢查結(jié)果，更加綜合的反應(yīng)患者當(dāng)期病情。目前，盡管在外周血中檢測(cè)到CTC并不意味著體內(nèi)一定存在微轉(zhuǎn)移灶，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CTC在腫瘤的演變過(guò)程中存在進(jìn)化，從原發(fā)部位向遠(yuǎn)處器官擴(kuò)散時(shí)會(huì)出現(xiàn)基因型的改變，可成為腫瘤原發(fā)部位和微轉(zhuǎn)移灶之間的橋梁，并能反應(yīng)微轉(zhuǎn)移灶的性質(zhì)[5,15]。這可彌補(bǔ)影像學(xué)和腫瘤標(biāo)志物等檢查無(wú)法及時(shí)精確反映轉(zhuǎn)移灶性質(zhì)的缺陷，對(duì)病情分期的評(píng)估和治療方案的制定都具有影響，從而選擇適宜的治療方式，避免過(guò)多的細(xì)胞毒性及治療方案的不足，在提高TNM分期準(zhǔn)確性的同時(shí)對(duì)肺癌個(gè)體化治療的開(kāi)展也具有一定的意義。

5 肺癌CTC與預(yù)后

對(duì)肺癌CTC的研究[4,15,16]顯示CTC具有重要的預(yù)后價(jià)值。Chen等[16]通過(guò)巢式RT-PCR法檢測(cè)行放化療的67例NSCLC患者，發(fā)現(xiàn)治療前CK19 mRNA陰性而治療后轉(zhuǎn)為陽(yáng)性的患者的無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival,PFS）和總生存期（overall survival, OS）均較短；在治療過(guò)程中CK19 mRNA持續(xù)陽(yáng)性的患者預(yù)后最差。多變量分析顯示CK19 mRNA可作為NSCLC患者PFS和OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Yoon等[17]應(yīng)用巢式實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)79例NSCLC患者的TTF-1 mRNA，發(fā)現(xiàn)術(shù)后陽(yáng)性患者的PFS比陰性患者較短，提示TTF-1 mRNA陽(yáng)性的CTC與病情進(jìn)展程度有關(guān)。Tanaka等[4]應(yīng)用Cell Search System發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)量在肺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中增加，對(duì)監(jiān)測(cè)病情變化和判斷預(yù)后具有重要意義。目前，已有大量研究顯示晚期肺癌患者CTC陽(yáng)性率明顯高于早期患者，但CTC與肺癌預(yù)后的研究大都尚限于NSCLC，針對(duì)SCLC的研究較少，且肺癌CTC的檢測(cè)方法和使用的腫瘤標(biāo)志物亦不同，所以關(guān)于CTC與肺癌的預(yù)后關(guān)系尚需病例數(shù)更多、設(shè)計(jì)更為嚴(yán)格的多中心臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

6 肺癌CTC與治療

當(dāng)前對(duì)肺癌的治療是基于腫瘤病理分級(jí)、患者一般狀況及腫瘤發(fā)展趨勢(shì)等因素之上的綜合治療。但遵循統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)建立的治療方案缺乏個(gè)體化。隨著對(duì)CTC研究的深入發(fā)現(xiàn)其可反映腫瘤組織基因的表達(dá)變化，有助于監(jiān)測(cè)療效及建立個(gè)體化的治療方案。

肺癌腫瘤組織基因的表達(dá)或突變可在治療過(guò)程中變化，從而導(dǎo)致藥物敏感性的改變，如耐藥基因T790M可導(dǎo)致對(duì)吉非替尼敏感的NSCLC治療失敗。Maheswaran等[5]應(yīng)用CTC-chip檢測(cè)接受吉非替尼治療的NSCLC患者的CTC，發(fā)現(xiàn)CTC的基因突變與腫瘤組織具有高度一致性，同樣存在EGFR突變（T790M），且在治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)量的改變可以反映患者病情的變化趨勢(shì)和治療的療效。在這之前，Nagrath等[3]對(duì)9例NSCLC患者的研究結(jié)果與之相似，發(fā)現(xiàn)在評(píng)估化療的療效上CTC數(shù)量的改變與按照實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）進(jìn)行CT影像學(xué)檢查的結(jié)果具有高度一致性。Bepler等[18]對(duì)30例接受吉西他濱方案治療的局部進(jìn)展期NSCLC患者跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)RRM1 mRNA的表達(dá)與療效呈負(fù)相關(guān)，即吉西他濱對(duì)高表達(dá)者療效差，對(duì)低表達(dá)者療效好。Wu等[19]應(yīng)用Cell Search System對(duì)12例化療2個(gè)療程的肺癌患者跟蹤隨訪，也發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)量與化療后影像學(xué)的應(yīng)答存在關(guān)系，提示CTC可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)化療肺癌患者的療效。

總之，CTC對(duì)肺癌個(gè)體化治療有潛在的重大意義，有望依靠非侵入性的血液檢測(cè)獲悉當(dāng)前治療的療效，起到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的作用，從而利于臨床醫(yī)師及時(shí)調(diào)整治療策略，達(dá)到個(gè)體化治療目的，但能否替代原發(fā)組織標(biāo)本指導(dǎo)分子靶向治療，并對(duì)服用吉非替尼等分子靶向藥物治療進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及避免耐藥基因的出現(xiàn)而影響療效，尚需通過(guò)大規(guī)模的前瞻性研究來(lái)證實(shí)。

7 展望與結(jié)語(yǔ)

伴隨現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，CTC檢測(cè)的敏感性和特異性均明顯提高，使探討其臨床應(yīng)用價(jià)值成為可能。2004年Cell Search System已被美國(guó)食品藥物管理署（FDA）批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，但只限于預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌（metastatic breast cancer, MBC）、前列腺癌和結(jié)直腸癌的PFS和OS的應(yīng)用，而未能臨床應(yīng)用于肺癌。對(duì)于MBC、前列腺癌和結(jié)腸癌而言，CTC已被認(rèn)為是一種可靠的預(yù)后指標(biāo)，能在治療過(guò)程中預(yù)測(cè)病情的進(jìn)展和患者的生存時(shí)間；而監(jiān)測(cè)結(jié)果能更早地為臨床醫(yī)師提供更豐富的信息，從而有利于制定更明確的治療方案。37%MBC、57%前列腺癌、30%結(jié)腸癌患者外周血樣本中都可以檢出≥2個(gè)CTC，而健康志愿者和非惡性腫瘤患者外周血樣本中幾乎沒(méi)有這種現(xiàn)象[20]。

2007年Nagrath等[3]率先報(bào)道了CTC-chip比Cell Search System分離純度高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)，更有利于分子生物學(xué)檢測(cè)。為能將CTC用于肺癌的日常臨床工作，尚需通過(guò)大規(guī)模、多中心的研究建立快速、靈敏、精確的檢測(cè)方法。目前，肺癌CTC的檢測(cè)及臨床應(yīng)用還沒(méi)有一致的標(biāo)準(zhǔn)，但從以上理論和已有的研究結(jié)果來(lái)看，CTC至少具有以下幾點(diǎn)潛在應(yīng)用價(jià)值，即在早期患者中發(fā)現(xiàn)隱匿性微轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)肺癌患者病情進(jìn)展和評(píng)價(jià)患者對(duì)治療的反應(yīng)。

2009年美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)（ASCO）大會(huì)上就有學(xué)者高度強(qiáng)調(diào)CTC在癌癥患者中的重要應(yīng)用價(jià)值，認(rèn)為CTC可作為實(shí)時(shí)液體活檢和臨床常規(guī)檢測(cè)中較為理想的標(biāo)本來(lái)源。對(duì)肺癌CTC的進(jìn)一步研究將有助于闡明肺癌的生物學(xué)特性，在肺癌未來(lái)的綜合診治中可能將更多的考慮CTC的存在及其特性，相應(yīng)檢測(cè)有望成為肺癌患者的臨床常規(guī)檢查，為患者帶來(lái)福音。