非小細(xì)胞肺癌治療的新靶點(diǎn)：EML4-ALK融合基因

王慧娟 袁靜 綜述 馬智勇 審校

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占80%。2007年Soda等[1]在NSCLC患者腫瘤標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn)由2號染色體短臂內(nèi)轉(zhuǎn)位inv（2）（p21p23）形成的棘皮動物微管相關(guān)類蛋白4（echinoderm microtubule-associated proteinlike4, EML4）與間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）的融合基因。已有研究[2]表明EML4-ALK可誘導(dǎo)腫瘤生成，給予ALK抑制劑后腫瘤可迅速消退。在目前已報(bào)道的研究中EML4-ALK融合基因在NSCLC中的陽性率約為5%，EML4-ALK融合基因已成為肺癌臨床治療新靶點(diǎn)。本文旨在介紹EML4-ALK基因的結(jié)構(gòu)、功能及生物學(xué)特征，探討EML4-ALK的最佳檢測方法，并評價(jià)其在肺癌治療中的地位和意義。

1 EML4-ALK融合基因的結(jié)構(gòu)與融合型

ALK屬于胰島素受體超家族，能與多種基因發(fā)生融合，如NPM-、TPM3-、TFG-、ATIC-、CLTC-等。它有著受體酪氨酸激酶的經(jīng)典結(jié)構(gòu)：細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)。其細(xì)胞外區(qū)包含特殊的結(jié)合域：N端信號肽，2個(gè)甲基多巴，A5蛋白和受體蛋白酪氨酸磷酸酶μ（MAM, meprin, A5 protein and receptor protein tyrosine phhosphatase mu）域，1個(gè)低密度脂蛋白類A（LDLa,Low-density lipoprotein A）基序以及1個(gè)靠近細(xì)胞膜的甘氨酸富集區(qū)（G-rich, Glycine-rich）。MAM域和G-rich區(qū)可能與ALK活化有關(guān)[3]。人類的ALK激酶區(qū)YxxxYY基序的第一個(gè)酪氨酸殘基-Tyr1604已被證明與ALK激酶區(qū)的自體活化有關(guān)[4]。

EML4屬于棘皮動物微管相關(guān)類蛋白家族，由N端Basic區(qū)、HELP域、WD-重復(fù)區(qū)構(gòu)成。這3個(gè)區(qū)域都與EML4-ALK的腫瘤生成潛能有關(guān)，其中Basic區(qū)在EML4-ALK二聚體化過程中扮演重要角色，去除Basic區(qū)可使EML4-ALK融合蛋白的催化活性大大減低（84%），因此，Basic區(qū)可能為EML4-ALK融合蛋白產(chǎn)生效應(yīng)的關(guān)鍵區(qū)域。Basic區(qū)靠近N端包含有一段螺旋卷曲，全部由EML4的2號外顯子編碼，稱為CC（coiled coil 螺旋卷曲）區(qū)，在多種ALK融合基因的融合對象中都存在，它可能是Basic區(qū)內(nèi)參與EML4-ALK二聚體化的主要基序[1,5]。

EML4與ALK的基因序列在2號染色體短臂上方向相反，相隔12 Mb，融合時(shí)須二者之一反向與對方相接，二者斷裂并相接的位置是區(qū)分各種EML4-ALK基因融合型的依據(jù)。所有ALK基因融合都發(fā)生在20號外顯子編碼的一段序列，而EML4斷裂點(diǎn)則表現(xiàn)出多變性，已經(jīng)檢測到的斷裂點(diǎn)有2、6、13、14、15、17、18、20號外顯子，形成了11種EML4-ALK融合基因型，它們中的大部分被證實(shí)有促進(jìn)腫瘤生成的活性[1,5-11]。

圖 1 EML4-ALK融合基因和重要的下游信號傳導(dǎo)通路Fig 1 ALK fusion oncogenes and important downstream signaling pathways

2 EML4-ALK融合基因的信號傳導(dǎo)通路及相關(guān)基因

NPM-ALK是目前研究最多的一種ALK融合基因，它的信號傳導(dǎo)主要和PLCγ、PI3K/Akt、Ras/Mek/Erk及JAK3/STAT3通路有關(guān)。Li等[12]采用小分子ALK抑制劑阻斷EML4-ALK融合基因的信號傳導(dǎo)通路，探索其下游的信號傳導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EML4-ALK與NPM-ALK有相似的下游信號傳導(dǎo)通路，主要包括Akt、 Erk和STAT3（圖1）。

與Li等[12]的研究結(jié)論不同，Koivunen等[7]發(fā)現(xiàn)ALK特異性抑制劑TAE684治療與H3122細(xì)胞凋亡以及Akt和Erk1/2信號的下調(diào)相關(guān)， 但卻僅引起了H3122細(xì)胞STAT3磷酸化水平很小程度上的降低。Choi等[6]的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了EML4-ALK的HEK293細(xì)胞在表現(xiàn)出腫瘤生成活性的同時(shí)，活化了Fos和Myc基因的啟動子，誘導(dǎo)了NF-κB結(jié)合序列的活化，但STAT3基因沒有明顯變化。而最近Takezawa等[13]報(bào)道ALK抑制劑誘導(dǎo)的EML4-ALK陽性肺癌細(xì)胞的凋亡主要是由BIM上調(diào)抑制Erk通路以及survivin下調(diào)抑制STAT3通路介導(dǎo)。

STAT3通路對于NPM-ALK介導(dǎo)的淋巴瘤生成十分重要，單獨(dú)抑制STAT3即能充分誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上關(guān)于EML4-ALK融合基因的研究中STAT3信號通路的作用變化不一，可能的原因是：①表達(dá)EML4-ALK融合基因的不同細(xì)胞系對EML4-ALK信號傳導(dǎo)通路的依賴性存在差異。Koivunen等[7]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了EML4-ALK融合基因的細(xì)胞系H3122在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中都對TAE684十分敏感，而另外2種表達(dá)EML4-ALK融合基因的細(xì)胞系，一種（H2228）對TAE684產(chǎn)生耐藥，而另一種（DFCI032）則需要同時(shí)使用EGFR和ERBB2抑制劑才能抑制細(xì)胞生長；②表達(dá)EML4-ALK融合基因的不同細(xì)胞系其ALK信號傳導(dǎo)的側(cè)重點(diǎn)可能不同。Li等[12]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了EML4-ALK融合基因的H2228細(xì)胞在經(jīng)過TAE684治療后出現(xiàn)了細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因CDC2、CDC7、CDK4等都下調(diào)了，ALK、Akt、STAT3、ERK的磷酸化也受到抑制；而轉(zhuǎn)染了EML4-ALK融合基因的H3122細(xì)胞經(jīng)TAE684作用后則側(cè)重于促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞周期的阻滯作用不明顯。因此與細(xì)胞凋亡和存活相關(guān)的基因STAT3及Akt均表現(xiàn)出磷酸化水平明顯減低，而與細(xì)胞生長及分化相關(guān)的基因ERK變化則不明顯。

表 1 肺腺癌中EML4-ALK融合基因陽性與EGFR、K-ras基因突變的關(guān)系Tab 1 Relationship between EML4-ALK fusion and genetic features in lung adenocarcinomas

3 EML4-ALK融合基因陽性NSCLC患者的臨床、病理及生物學(xué)特征

目前研究[14]發(fā)現(xiàn)年齡＜50歲的患者較年齡≥50歲的患者EML4-ALK融合基因陽性率高（P＜0.01）。吸煙者較不吸煙者的陽性率低（P＜0.000,1）[15]。Inamura等[16]在2008年的研究結(jié)果中顯示腫瘤直徑大小與EML4-ALK融合基因表達(dá)無關(guān)，但在2009年擴(kuò)大樣本量的研究[14]中發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑＜30 mm較≥30 mm的患者EML4-ALK融合基因陽性率高（P＜0.05）。目前尚未發(fā)現(xiàn)性別、分期與EML4-ALK融合基因表達(dá)相關(guān)。

EML4-ALK融合基因在腺癌中的陽性率高于非腺癌（P＜0.05）[10,17]，腺泡癌的陽性率高于其它類型的腺癌（P＜0.001）[14,16]。與EML4-ALK融合基因陰性者相比，EML4-ALK融合基因陽性肺癌組織的癌細(xì)胞內(nèi)、外富含粘液素（P＜0.000,1），由于過多的細(xì)胞外粘液素，肺癌組織形態(tài)呈篩孔樣（P＜0.000,1），細(xì)胞內(nèi)富含粘液素則形成印戒細(xì)胞[18]，印戒細(xì)胞的比例超過總細(xì)胞數(shù)的10%[19]。 Takahashi等[10]報(bào)道分化差的較分化好的肺癌EML4-ALK融合基因陽性率高（P＜0.01），而其它研究中未發(fā)現(xiàn)組織分化程度與EML4-ALK融合基因陽性率相關(guān)。

存在EGFR、K-Ras基因突變的患者，其EML4-ALK融合基因陽性率較EGFR及K-Ras基因野生型者低（P＜0.05）（表1）。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道EML4-ALK融合基因陽性的肺癌患者，通常不伴有EGFR和/或K-Ras基因突變。

4 EML4-ALK融合基因的檢測方法評價(jià)

目前研究報(bào)道的肺癌組織中EML4-ALK融合基因檢測的陽性率有很大差別，除了病例選擇上的偏倚外，檢測方法的不統(tǒng)一、無標(biāo)準(zhǔn)也是主要相關(guān)原因。常用的檢測EML4-ALK融合基因的方法主要有反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RTPCR）法、熒光原位雜交（f l uorescence in situ hybridization,FISH）法和免疫組織化學(xué)（immunohistochemical, IHC）法。

RT-PCR法是一種敏感性高的基因檢測方法，多重RT-PCR常用來鑒別EML4-ALK基因的融合型。但RT-PCR需要高質(zhì)量的RNA，石蠟切片中的DNA及RNA在檢測過程中會逐漸降解，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，RTPCR法更適用于新鮮標(biāo)本的基因檢測。

FISH法采用探針特異性標(biāo)記細(xì)胞核中ALK斷裂點(diǎn)來檢測ALK重排，分離的熒光信號提示存在ALK重排。當(dāng)IHC結(jié)果為弱陽性或陽性部位十分有限的時(shí)候，可用FISH法進(jìn)行確認(rèn)。但由于其價(jià)格昂貴，分離的熒光信號不易解釋，F(xiàn)ISH還不適合成為EML4-ALK融合基因的篩查手段。

IHC法是實(shí)驗(yàn)室最常用的蛋白篩查與診斷方法，操作簡便，且已有研究表明IHC檢測EML4-ALK融合基因的結(jié)果和RT-PCR、FISH法的檢測結(jié)果具有一致性，建議使用IHC法作為篩查EML4-ALK融合基因的方法，但I(xiàn)HC法的敏感性不如RT-PCR和FISH法。有研究[9,20]表明使用抗體增強(qiáng)劑（iAEP）及敏感性、特異性高的抗體，如5A4抗體、CD246抗體（克隆號：D5F3）可以克服這一缺點(diǎn)，使得IHC法用于篩選ALK抑制劑的潛在有效人群成為可能。

5 EML4-ALK融合基因陽性NSCLC患者的預(yù)后、臨床過程及對治療的反應(yīng)

從發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因在肺癌組織中表達(dá)至今僅3年，很多研究者已把EML4-ALK融合基因陽性的肺癌患者看做獨(dú)立的肺癌亞型，但對于這部分患者的臨床結(jié)局及對治療的反應(yīng)尚沒有大宗的病例報(bào)告，現(xiàn)在僅能從個(gè)別研究中窺見一斑。Takahashi等[10]觀察了4例EML4-ALK融合基因陽性的可手術(shù)肺癌患者的預(yù)后及臨床病程：其中2例Ia期的腺癌患者生存期超過了60個(gè)月，沒有出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；1例IIIa期患者生存超過99個(gè)月，在手術(shù)后73個(gè)月出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移；另1例IIIa期患者在術(shù)后8個(gè)月出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移，至研究結(jié)束已存活53個(gè)月。Murakamia等[21]曾報(bào)道了1例EML4-ALK陽性患者手術(shù)后20年復(fù)發(fā)。以上研究提示EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者可能臨床病程較長，預(yù)后較好，但尚需更多病例的觀察與比較才能確認(rèn)。

有研究[22]發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因陽性患者及EGFR、EML4-ALK基因雙野生型（WT/WT）的患者對酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）治療的反應(yīng)不明顯，對以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療的反應(yīng)率也低于EGFR突變患者，提示EML4-ALK融合基因陽性患者不同于EGFR突變患者，似乎不能作為化療療效的正面預(yù)測因子。此外，EML4-ALK融合基因陽性患者的中位生存期（median survival time, MST）及總生存期（overall survival,OS）較WT/WT患者長一些但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EGFR基因突變患者的疾病進(jìn)展時(shí)間（time to progression, ヰP）及總生存時(shí)間（overall survival, OS）則明顯長于WT/WT者。由以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管EML4-ALK融合基因陽性患者對治療的反應(yīng)率及生存指標(biāo)方面都略遜于EGFR突變患者，但好于WT/WT患者，給予相應(yīng)的抑制劑治療后，EML4-ALK融合基因陽性患者的生存期可能會更長。

一項(xiàng)關(guān)于ALK抑制劑TAE684的研究[7]報(bào)道，3個(gè)存在EML4-ALK易位的細(xì)胞系中H3122細(xì)胞系對TAE684治療特別敏感；DFCI032細(xì)胞系中同時(shí)存在EGFR和ERBB2基因的共活化，對TAE684治療不十分敏感；而H2228細(xì)胞系則對TAE684產(chǎn)生耐藥，未檢測到其它激酶的共活化，耐藥原因尚不清楚。Choi等[23]在1例ALK抑制劑耐藥的NSCLC患者的瘤細(xì)胞中檢測到了EML4-ALK融合基因內(nèi)的二次突變，分別發(fā)生在第4374號堿基（G→A）和第4493號堿基（C→A），導(dǎo)致對應(yīng)位置的1156號氨基酸（半胱氨酸→酪氨酸）和1196號氨基酸的改變（亮氨酸→甲硫氨酸），并證實(shí)這兩個(gè)點(diǎn)突變都與ALK抑制劑耐藥有關(guān)，但不清楚這兩個(gè)點(diǎn)突變發(fā)生在用藥前還是用藥后。以上研究表明，EML4-ALK抑制劑在臨床上可能只對一部分包含EML4-ALK易位的NSCLC患者有效，其它受體酪氨酸激酶的活化以及EML4-ALK融合基因內(nèi)的二次突變可能是引起ALK抑制劑耐藥的原因。

Soda等[2]培育了肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)EML4-ALK融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，幾周后發(fā)現(xiàn)這些小鼠的雙肺長出了成百上千的腺癌結(jié)節(jié)，給予ALK活性抑制劑（2,4-嘧啶二胺）后，這些癌結(jié)節(jié)很快消退，但殘存的腫瘤細(xì)胞仍有活性，停藥25天后小鼠肺部又長出了大小不一的癌結(jié)節(jié)。這些結(jié)果支持EML4-ALK是驅(qū)動肺癌發(fā)生的原癌基因的理論，為使ALK抑制劑達(dá)到更好更穩(wěn)定的療效，需要延長給藥時(shí)間或加大給藥劑量。另外，轉(zhuǎn)染EML4-ALK融合基因后的細(xì)胞中可能有其它信號通路的激活，通過抑制其它激活的信號通路也是提高療效的一種潛在方法。

目前已進(jìn)入臨床研究的ALK抑制劑只有crizotinib（PF-02341066），它同時(shí)也是MET抑制劑。I期臨床試驗(yàn)[24]顯示其客觀緩解率為57%，疾病控制率是90%，中位無進(jìn)展生存期9.2個(gè)月。II期臨床試驗(yàn)[25]中客觀緩解率為64%，疾病控制率為90%，生存終點(diǎn)還在觀察中。不良反應(yīng)主要是胃腸道反應(yīng)，包括惡心、嘔吐和腹瀉。該藥抗癌效果滿意，安全性好，已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)（Profi le-1007）。

6 結(jié)論

綜上所述，EML4-ALK融合基因已經(jīng)成為NSCLC治療的新靶點(diǎn)，一部分EML4-ALK陽性的患者可從ALK抑制劑治療中獲益。EML4-ALK融合基因陽性的患者，通常為年齡＜50歲、不吸煙、腫瘤直徑＜30 mm、病理類型為腺癌，不伴有EGFR、K-ras基因突變的個(gè)體。在臨床研究中可先通過以上特征初步篩選出可能的獲益人群，之后再行EML4-ALK融合基因或蛋白檢測可事半功倍，IHC法可能是目前篩查EML4-ALK融合基因的最佳手段。

但是，EML4-ALK融合基因的研究仍有許多待解決的問題，比如Martelli等[26]的研究中使用RT-PCR法在120例冰凍NSCLC標(biāo)本及遠(yuǎn)離腫瘤的肺組織中均檢測到了EML4-ALK融合基因，但未檢測到EML4-ALK蛋白表達(dá)，研究者認(rèn)為這是因?yàn)楸磉_(dá)EML4-ALK融合基因的細(xì)胞數(shù)太少所致。已往大多數(shù)研究已從基因和蛋白水平證實(shí)了肺癌中EML4-ALK融合基因存在，且基因和蛋白檢測結(jié)果一致。該實(shí)驗(yàn)中基因蛋白分離的情況值得深思，蛋白水平檢測陰性的情況下，盡管檢測到了EML4-ALK融合基因，該基因是否行使了促進(jìn)腫瘤生成的功能，這類患者是否適合接受ALK抑制劑治療有待繼續(xù)深入研究。另外，EML4-ALK的信號通路方面的研究較少，該信號通路是否和EGFR信號通路有相互交疊及相互影響尚不明確，需要進(jìn)一步研究探討。