CIK細胞及其在肺癌治療中的研究進展

羅虎 周向東

肺癌尤其是小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）因其惡性程度高、預(yù)后差（5年生存率＜5%），已經(jīng)成為各種癌癥中導(dǎo)致死亡的首要原因[1]。由于手術(shù)切除的不徹底性、肺癌細胞對化療的多重耐藥性（multidrug resistance, MDR）和對放療的低敏感性以及不可忽視的副作用等原因，肺癌的復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移等難題長期不能得到有效解決。當(dāng)傳統(tǒng)治療手段無法為肺癌患者提供滿意的長期生存期，新的治療方法應(yīng)運而生。

近年來基于免疫細胞在惡性腫瘤治療方面的巨大潛力，過繼免疫作為生物治療的有效手段之一已成為近年來腫瘤治療的重要研究方向。到目前為止多種免疫細胞如樹突狀細胞（dentritic cells, DC）[2,3]、細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes, CTL）[4,5]、自然殺傷細胞（natural killer cells, NK）[6]、淋巴因子激活殺傷細胞（lymphokine-activated killer cells, LAK）[7]、抗CD3單克隆抗體誘導(dǎo)的殺傷細胞（anti-CD3 monoclonal antibody-induced killer cells, CD3AK）[8]、腫瘤浸潤淋巴細胞（tumorinfiltrating lymphocytes, TIL）[9]等曾被用于腫瘤治療的實驗研究或臨床治療并顯示出一定的抗癌能力。但由于體外擴增能力受限或安全性方面的問題，這些免疫細胞在大規(guī)模臨床試驗研究中受到一定限制。而Schmidt-Wolf等[10]于1991年首次報道的細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokineinduced killer cells, CIK）因其在體內(nèi)外展現(xiàn)出來的強大抗腫瘤活性而備受關(guān)注，迅速成為腫瘤免疫治療的前沿和熱點。

1 CIK細胞

研究[11]認為CIK細胞來源于CD3+CD56-T細胞，是激活的II型T淋巴細胞且同時兼具NK細胞的殺傷特性。但CIK細胞在外周血中含量甚微（約1%-5%）。因此要將CIK細胞用于臨床治療，首先必須進行大量擴增。CIK細胞的產(chǎn)生過程大致如下：利用密度梯度離心法將患者或健康人外周血中單核細胞分離出來后，通過添加外源性細胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-1、OKT3（抗CD3的一種單克隆抗體）進行體外誘導(dǎo)擴增。體外擴增2周-4周后，培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量具有強抗癌活性的異質(zhì)細胞群，即為CIK細胞。CIK細胞主要包括CD3+CD56+T細胞、CD3+CD56-T細胞以及CD3-CD56+T細胞，其中CD3+CD56+T細胞亞群被認為是發(fā)揮抗癌活性的主力軍，約占CIK細胞數(shù)量的40%-75%（也有文獻將CD3+CD56+T定義為CIK細胞）。

各種外源性細胞因子的作用和機制并不相同，如IL-2的作用機制可能是通過其受體共用鏈IL-2Rβ鏈和γ鏈，經(jīng)Jak/Stat信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細胞增殖，同時促進NK細胞和T細胞定向分化為效應(yīng)細胞發(fā)揮殺傷作用；OKT3的作用主要是刺激T細胞的增殖，而對細胞毒活性影響不大；而IFN-γ和IL-1對提高細胞毒活性非常重要，并且不同的添加順序?qū)毎净钚杂绊懮醮?，將IFN-γ添加在IL-2之前可以明顯提高細胞毒活性，其機制在于IFN-γ可以誘導(dǎo)IL-2受體（IL-2R）的高表達，從而更有利于IL-2發(fā)揮作用。

2 CIK細胞基本特征

2.1 強大的體外擴增能力 大規(guī)模數(shù)量的殺傷活性細胞是過繼免疫用于臨床治療的前提條件。LAK細胞在臨床應(yīng)用方面受到嚴重限制，其主要原因在于其內(nèi)在的弱增殖活性，獲得一定數(shù)量的細胞需要大量的IL-2，因而造成的毒副作用尤其是毛細血管滲漏綜合征不容忽視。CIK細胞不僅具有簡單的體外擴增程序，其同樣具有強力的體外擴增能力。Jiang等[12]報道CIK細胞的增殖高峰出現(xiàn)在第21-28天，細胞數(shù)量高達上千倍。

2.2 非主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility antigens, MHC）非限制性的殺瘤活性 MHC限制性要求腫瘤細胞高表達某些信號分子以供自身抗原遞呈細胞識別，進而激活T細胞殺傷功能發(fā)揮抗腫瘤作用。但是近年研究證實，腫瘤細胞的免疫逃避機制也是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因之一。CIK細胞是最終效應(yīng)細胞，可以通過MHC非限制性途徑[13]發(fā)揮對腫瘤細胞的直接殺傷作用，而對正常細胞沒有影響。

2.3 強大的細胞毒活性 CIK細胞的抗腫瘤活性主要依賴于CD3+CD56+T細胞的直接殺傷能力。Wang等[14]利用膠質(zhì)瘤細胞系U87和U251比較CIK細胞和LAK細胞的抗癌能力，研究證實CIK細胞擁有比LAK細胞更加強大的抗腫瘤能力。而Kim等[15]研究表明，當(dāng)CIK細胞與靶細胞比值為30:1時，98%的NCI-H460肺癌細胞可被殺滅，進一步證實了CIK細胞強大的細胞毒活性以及應(yīng)用于臨床的巨大潛力。

2.4 副作用少，應(yīng)用安全 免疫細胞應(yīng)用于臨床首先必須解決安全性問題，TIL細胞在臨床應(yīng)用方面受到限制，主要是因為在細胞制備過程中，腫瘤細胞的摻入有可能帶來癌變的風(fēng)險。到目前為止，大量的動物實驗和臨床研究表明CIK細胞副反應(yīng)少，毒副作用低，臨床應(yīng)用相對安全可靠。在一項40例病例參與的臨床隨機對照研究中，研究者[16]利用臍血來源的CIK細胞治療包括肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等在內(nèi)的多種實體瘤，觀察其副作用發(fā)現(xiàn)共有4例病例出現(xiàn)發(fā)熱、流感樣癥狀、乏力、肌痛癥狀，對癥處理后可以完全緩解。

3 CIK細胞作用機制

3.1 CIK細胞直接細胞毒活性 CIK細胞強大的抗癌能力主要歸功于其CD3+CD56+T細胞亞群的直接細胞毒活性。這種直接殺傷機制可概括為：CIK細胞表面表達某些趨化因子或趨化因子受體，可誘導(dǎo)其定向到達腫瘤細胞，通過細胞表面的受體和腫瘤細胞表面的配體結(jié)合后，CIK細胞被激活。激活的CIK細胞釋放穿孔素和細胞毒顆粒如α-氮-甲苯碳酰基-左旋-賴氨酸硫甲苯酯，這些顆粒能夠直接穿透封閉的靶細胞進行胞吐，從而導(dǎo)致癌細胞的裂解，但是整個過程不依賴于T細胞表面受體和Fas受體[17]。同時，利用MHC I類和II類抗體不能阻滯CIK細胞對靶細胞的殺傷作用，整個過程是非MHC限制的。研究[10]證實，在CIK細胞與靶細胞的接觸過程中利用淋巴因子功能相關(guān)抗原（lymphocyte function-associated antigen 1, LFA-1）或其配體細胞粘附分子（inter cellular adhesion molecule 1,ICAM-1）的單克隆抗體均可有效降低CIK細胞的殺傷活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在CIK細胞與靶細胞的接觸過程中，CIK細胞表面的FcR使LFA-1和ICAM-1的結(jié)合狀態(tài)從低親和力轉(zhuǎn)為高親和力狀態(tài)是其釋放細胞毒顆粒的前提，這些均表明細胞表面粘附分子在CIK細胞對腫瘤細胞的識別過程中起到重要作用。另外，研究[18]認為CIK細胞表面分子如NKG2D、DNAM-1及NKp30等在CIK與靶分子的識別過程中起到重要作用。

3.2 分泌和免疫調(diào)節(jié) CIK細胞兼具T細胞和NK的殺傷活性，同時作為免疫細胞可以分泌多種炎性因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和GM-CSF等，直接或間接參與殺傷腫瘤細胞。Kornacker等[19]在用CIK細胞治療慢性淋巴細胞白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，CIK細胞分泌的IFN-γ能誘導(dǎo)慢性淋巴細胞白血病細胞上粘附分子ICAM-1的高表達，進而提高CIK細胞誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力。另外，CIK細胞可以與機體抗原遞呈細胞如樹突狀細胞相互作用，可提高樹突狀細胞的專職抗原遞呈能力，刺激機體CTL大量增殖，從而大大刺激了機體對腫瘤細胞的反應(yīng)性，對于機體主動免疫應(yīng)答起到很好的促進作用。

3.3 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡或壞死 加速或誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡或壞死也是近年來腫瘤治療的重要研究方向。同時，Sun等[20]報道了CIK細胞可以誘導(dǎo)MGC-803胃癌細胞的凋亡并抑制其增殖能力，免疫組化等方法證實CIK細胞殺傷胃癌細胞的機制為下調(diào)p53、C-myc和Bcl-2等基因的表達，上調(diào)Bax基因的表達，從而起到早期誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，晚期誘導(dǎo)其壞死的效果。師巖等[21]研究證實，CIK細胞能誘導(dǎo)人肺癌細胞A549出現(xiàn)凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化，流式細胞分析法檢測早期凋亡率發(fā)現(xiàn)CIK實驗組明顯高于對照組，提示體外培養(yǎng)的CIK細胞可明顯誘導(dǎo)人肺癌細胞A549凋亡。

4 CIK細胞用于肺癌治療的研究進展

近年隨著過繼免疫的迅速發(fā)展，CIK細胞也成為一種新的免疫細胞而倍受青睞。大量關(guān)于CIK細胞的動物實驗和臨床研究證實了CIK細胞用于腫瘤治療的廣闊前景。到目前為止，CIK細胞用于治療肝癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、腎細胞癌以及各種類型白血病[22-25]等取得初步成效，在肺癌治療方面也有新的進展。

4.1 CIK細胞治療肺癌 Kim等[15]報道在體外實驗中，當(dāng)CIK與肺癌細胞數(shù)比值為30:1時，98%的NCI-H460肺癌細胞可被殺滅。在動物實驗中，當(dāng)CIK細胞數(shù)為3×105個和3×106個時，利用NCI-H460肺癌細胞接種產(chǎn)生的腫瘤體重可分別減輕57%和77%。李淑艷等[26]研究發(fā)現(xiàn)CIK細胞在體內(nèi)外抑制Lewis肺癌細胞增殖，F(xiàn)as/FasL途徑在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡中發(fā)揮一定作用，同時CIK細胞抗腫瘤作用可能與淋巴細胞活化和分泌細胞因子有關(guān)。臨床應(yīng)用方面，Lin等[27]報道了1例伴發(fā)肺癌和類腫瘤皮膚病的多發(fā)性骨髓瘤病例，患者在接受CIK細胞治療后可有效控制肺癌進展。劉啟亮等[28]和李文等[29]分別利用自體CIK細胞治療晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者取得初步療效。其中，后者療效評價中總緩解率為78.1%，臨床癥狀評分改善率為86.4%-92.9%，1年生存期達到80.4%。這些臨床研究證據(jù)表明CIK細胞自體回輸可能是治療晚期肺癌良好過繼免疫治療方法，可延長患者的生存期，改善患者的生活狀況，且未見明顯的毒副作用。

4.2 聯(lián)合DC與CIK細胞治療肺癌 CIK細胞在腫瘤治療方面具有巨大潛力，但是作為一種被動免疫治療并不能長久地控制腫瘤的生長，CIK細胞聯(lián)合DC疫苗成為主動免疫作為一種新的治療策略開始涌現(xiàn)。DC是人體內(nèi)主要的抗原遞呈細胞，其主要功能是誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)及維持T細胞的免疫應(yīng)答。另外，DC可以捕獲腫瘤相關(guān)抗原，表達淋巴細胞共刺激分子，分泌各種細胞因子并啟動細胞免疫和體液免疫。CIK細胞與DC共培養(yǎng)具有相互促進作用[30]，可明顯提高DC特異性的共刺激分子的表達和IL-12的分泌，進而提高CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。體外實驗中鄭秋紅等[31]和呂章春等[32]分別報道了腫瘤抗原致敏的DC誘導(dǎo)的CIK細胞對肺癌細胞的殺傷活性明顯高于單純的CIK細胞，隨著效靶比的升高，DC-CIK細胞對肺癌細胞的殺傷效應(yīng)隨之增強（P＜0.05），并探討DC增強CIK殺傷活性的可能機制為：DC表面的樹枝狀突起可使其負載腫瘤抗原并呈遞給CIK細胞，激活后的DC分泌IL-12、IL-18及IFN-γ等細胞因子，刺激Th0、Th2細胞向Th1細胞分化，并強烈激發(fā)Th1型特異性免疫應(yīng)答。周永春等[33]利用DC疫苗聯(lián)合CIK細胞治療70例NSCLC的臨床觀察顯示，DC-CIK治療組中II期、III期患者的有效率分別為39.30%和28.60%，與對照組的相應(yīng)期別（II期26.90%，III期22.20%）相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。體內(nèi)外實驗均提示腫瘤抗原負載的DC細胞可增強CIK細胞對肺癌細胞的殺傷活性，具有推廣運用的價值。

4.3 聯(lián)合化療與CIK細胞治療肺癌 盡管MDR的出現(xiàn)導(dǎo)致各種惡性腫瘤對化療的反應(yīng)不盡人意，化療仍然是多種肺癌尤其是SCLC患者的首選治療方案。多項研究[4,34,35]證實，化療可以通過殺滅免疫抑制細胞（如髓系抑制性細胞、調(diào)節(jié)性T細胞）等方式提高機體對抗腫瘤的免疫應(yīng)答，增加腫瘤細胞對免疫細胞的敏感性。在一項59例晚期NSCLC患者參與的前瞻性臨床研究中，Wu等[36]報道了與單獨的化療方案相比，聯(lián)合化療和CIK細胞治療晚期肺癌能明顯提高患者機體免疫應(yīng)答和生存質(zhì)量，其無進展生存期（P=0.042）和總生存期（P=0.029）均延長，且無明顯毒副作用。類似的，Niu等[16]將一線化療失敗的40例惡性腫瘤患者（包括15例肺癌患者）隨機分為兩組后分別予以二線化療和聯(lián)合二線化療與CIK細胞治療，其無進展生存時間分別為2.03個月和3.45個月（P=0.031）。這些研究結(jié)果表明聯(lián)合化療與過繼免疫可能作為一種新的治療方案為肺癌患者帶來更好的預(yù)后。

4.4 其他 鑒于CIK細胞在臨床應(yīng)用方面的巨大潛力，各種用于提高CIK細胞增殖活性或殺傷活性的策略不斷涌現(xiàn)。比如，王士勇等[37]通過添加重組人纖維蛋白片段能明顯增強CIK增殖活性，但對CIK細胞的殺傷活性并無明顯影響。多項研究[38-40]報道將DC疫苗、化療和CIK細胞三者聯(lián)合治療腫瘤也取得一定成就，可能成為未來肺癌治療的新趨勢。

5 CIK細胞存在的問題和未來的方向

盡管CIK細胞在體內(nèi)外展現(xiàn)出的強大細胞毒活性等優(yōu)勢給臨床肺癌治療帶來新的希望，但在CIK細胞廣泛應(yīng)用于臨床之前仍有許多問題丞待解決。

5.1 作用機制不夠明確 到目前為止，CIK細胞發(fā)揮其強大細胞毒活性的機制還不夠明確，尤其是其與宿主免疫之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系需要深入研究，因為明確的作用機制才能為臨床提供更好的理論基礎(chǔ)和治療靶點。如CIK細胞進入機體后，其激活機制和發(fā)揮直接殺傷活性的機制有待進一步闡明。另外，研究發(fā)現(xiàn)CIK細胞能夠刺激機體T細胞大量增殖，分泌各種細胞因子，起到調(diào)整機體免疫的功能，但是CIK細胞與機體免疫細胞之間的環(huán)路關(guān)系并不十分清楚。

5.2 CIK臨床應(yīng)用欠規(guī)范 科學(xué)、系統(tǒng)的制度和規(guī)范有助于CIK細胞臨床研究的開展，但到目前為止，CIK的制備和臨床使用還沒有形成統(tǒng)一的標準。如CIK細胞的數(shù)量和活力是保證臨床療效的關(guān)鍵，但是從肺癌臨床治療的文獻報道看，各個研究單位使用的CIK細胞的制備方案和輸注數(shù)量各有差異。另外，不同單位對臨床效果評價指標的選擇也不盡相同，由此導(dǎo)致CIK細胞的實際臨床效果很難得到準確評估。CIK細胞用于肺癌臨床治療的報道主要是個案研究、前瞻性研究和少數(shù)的隨機對照研究，且多為短期療效的評估；CIK細胞在肺癌臨床治療上的橫向比較（肺癌與其他腫瘤的治療效果對比）和縱向比較的（各種類型肺癌的治療效果對比）資料還比較缺乏，其對腫瘤強大殺傷作用和低毒副作用還沒有足夠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。因此，大規(guī)模的臨床隨機對照研究或高質(zhì)量的meta分析顯得非常必要。

5.3 CIK的發(fā)展趨勢和方向 如前所述，CIK細胞和DC疫苗、化療聯(lián)合應(yīng)用時具有相互促進作用，進而提高CIK細胞對肺癌細胞的殺傷活性。因此，聯(lián)合化療、DC疫苗和CIK細胞作為一種新的治療方案可能是未來肺癌乃至其他惡性腫瘤的發(fā)展方向，但是，聯(lián)合治療可能產(chǎn)生大量的過敏毒素和細胞因子[41]，因此帶來的副作用必須在應(yīng)用之前得到更好的研究。另外，體外實驗[16]發(fā)現(xiàn)CIK細胞可以下調(diào)A549/CDDP和K562/ADR細胞系中耐藥轉(zhuǎn)運蛋白ABCG-2和P-gp的表達，通過高表達CD3、CD56、FasL和CD59發(fā)揮對腫瘤耐藥細胞的殺傷活性，這無疑為以后耐藥相關(guān)腫瘤的臨床治療提供了新的思路。最后，CIK細胞在其他疾病如慢性乙型肝炎[42]的治療也見諸多報道，但其治療效果還有待進一步研究證實。

6 總結(jié)

肺癌作為癌癥導(dǎo)致死亡的首要原因，嚴重威脅著人類健康。傳統(tǒng)治療方案如手術(shù)、化療等往往不盡如人意，過繼免疫作為一種新的治療方法越來越受到重視，而CIK細胞由于其強大的增殖活性和細胞毒活性、非MHC限制性以及低毒副作用等優(yōu)點備受矚目。但是，在CIK細胞廣泛應(yīng)用于臨床為肺癌患者服務(wù)之前，還有諸多問題需要解決，相信隨著對CIK細胞的深入研究和更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的出現(xiàn)，過繼免疫治療肺癌將會有新的突破。