蛋白質(zhì)結(jié)晶方法的研究進展

劉四化，王倩倩，肖 良，張黎明

(第二軍醫(yī)大學(xué) 海醫(yī)系防化醫(yī)學(xué)教研室，上海 200433)

蛋白質(zhì)結(jié)晶方法的研究進展

劉四化，王倩倩，肖 良，張黎明

(第二軍醫(yī)大學(xué) 海醫(yī)系防化醫(yī)學(xué)教研室，上海 200433)

蛋白質(zhì)結(jié)晶是蛋白質(zhì)分子從過飽和溶液中析出形成晶體的過程，結(jié)晶是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是主要的技術(shù)難點。本文總結(jié)了常用的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法，介紹了近年來蛋白質(zhì)結(jié)晶相關(guān)的新技術(shù)和新策略。

蛋白質(zhì)結(jié)晶;蒸汽擴散;籽晶技術(shù);多孔材料;化學(xué)修飾

蛋白質(zhì)結(jié)晶即蛋白質(zhì)分子從過飽和的溶液中析出形成晶體。結(jié)晶的過程是蛋白質(zhì)分子相變的過程，分為晶核形成和晶體生長兩個階段。伴隨著晶核的形成，溶液中蛋白質(zhì)的濃度逐漸降低，推動體系向相對穩(wěn)定的區(qū)域轉(zhuǎn)變，該區(qū)域晶體長大而晶核數(shù)量不再增加［1］。晶核可以由均相成核或非均相成核兩種過程形成［2-3］，同時晶體的生長過程首先是處于過飽和臨界點的溶液體系中溶質(zhì)分子聚集在一起，其次是這些溶質(zhì)分子從無序集群到有序結(jié)構(gòu)的重組過程。大部分蛋白分子的結(jié)晶過程都遵循這一規(guī)律［4］。

蛋白質(zhì)結(jié)晶是結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要難點。盡管高通量結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的出現(xiàn)簡化了目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達、純化、結(jié)晶以及數(shù)據(jù)的收集過程，但仍然只有少量蛋白質(zhì)能生成滿足衍射要求的單晶［5］，這從側(cè)面反映了獲取蛋白質(zhì)優(yōu)質(zhì)單晶的困難程度。迄今為止，除已有大量經(jīng)驗積累外，還沒有發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件與其結(jié)構(gòu)之間有明顯的相關(guān)性，也沒有任何一套實驗系統(tǒng)或理論能保證優(yōu)良蛋白質(zhì)晶體的產(chǎn)生和生長。本文總結(jié)了傳統(tǒng)的結(jié)晶方法，同時介紹了蛋白質(zhì)結(jié)晶相關(guān)的新技術(shù)和新策略，相信對蛋白質(zhì)藥物的應(yīng)用研究會有一定啟發(fā)。

1 傳統(tǒng)結(jié)晶方法

1.1 蒸汽擴散結(jié)晶法

蒸汽擴散結(jié)晶法是最常用的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法，它形成的大分子晶體種類遠遠超過批量結(jié)晶和自由界面擴散結(jié)晶法［6］形成的大分子晶體種類。通常蒸汽擴散法分懸滴法和坐滴法兩種。懸滴法中待結(jié)晶液滴懸掛于蓋玻片的下方，而坐滴法中蛋白溶液位于樣品池溶液上方的底座上。一般懸滴法較常用，但坐滴法可借助顯微攝像技術(shù)自動監(jiān)測蛋白質(zhì)的結(jié)晶情況，更適于高通量蛋白質(zhì)的結(jié)晶實驗。

1.2 批量結(jié)晶法

蒸汽擴散結(jié)晶法結(jié)晶在方便的同時也存在較多缺陷，比如因液滴體積的改變、離子濃度變化引起的pH值的改變等，溫度的輕微變化會導(dǎo)致形成的結(jié)晶溶解等。而批量結(jié)晶法可將液滴孵育在低密度(0.87 g/cm3)石蠟油中，一段時間內(nèi)處于相對穩(wěn)定的體系中，體積和pH等不會改變，形成的晶體也不會被溶解［7］。與蒸汽擴散結(jié)晶法相比，批量結(jié)晶法操作簡單，比較適合于高通量實驗［8］，由于批量結(jié)晶法相變的數(shù)據(jù)比較少，篩選結(jié)晶條件的效率較低。而經(jīng)過改進，采用硅膠和石蠟的混合物比單一的石蠟有更高的篩選效率［9］，因而在微量批量結(jié)晶實驗中有較多的應(yīng)用。

1.3 透析結(jié)晶法

在透析結(jié)晶法中，大分子蛋白質(zhì)和小分子結(jié)晶劑之間由半透膜分開，兩邊存在的濃度梯度使得小分子結(jié)晶劑通過半透膜與大分子蛋白質(zhì)混合，而大分子的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，從而使膜內(nèi)溶液過飽和并產(chǎn)生蛋白質(zhì)晶體。該法的優(yōu)點在于尋找結(jié)晶的最佳條件過程中透析袋內(nèi)的蛋白質(zhì)可以重復(fù)使用。但是，透析結(jié)晶限制了諸如聚乙二醇(PEG)等結(jié)晶劑的使用，因為PEG吸出透析袋內(nèi)水分的速度遠大于其滲入膜的速度，從而導(dǎo)致袋內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。

用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的常規(guī)方法還有很多，如升華結(jié)晶、協(xié)同沉淀法結(jié)晶、凝膠擴散結(jié)晶、水熱法及溶劑熱法結(jié)晶、膜結(jié)晶等。隨著交叉學(xué)科的迅猛發(fā)展，越來越多的物理方法被應(yīng)用于這一研究領(lǐng)域，王弘等［10］對于常規(guī)的蛋白質(zhì)大分子結(jié)晶方法以及結(jié)晶的影響因素作了較詳細的總結(jié)。

2 新技術(shù)的應(yīng)用

2.1 籽晶技術(shù)

籽晶技術(shù)是指將劣質(zhì)的晶體植入與其結(jié)晶條件相似但不完全相同的新的體系中。籽晶技術(shù)最早應(yīng)用于結(jié)晶條件的優(yōu)化實驗，通過直接在亞穩(wěn)區(qū)加入已經(jīng)形核的籽晶(或晶核)，可保證有限的晶核生長成大的單晶［11］。D'Arcy等［12］開發(fā)了一種簡單、全自動的微晶技術(shù)，用導(dǎo)入籽晶的方法對牛胰島素等5種蛋白結(jié)晶條件進行了篩選，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入籽晶可以使蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的成功率提高2.5～65倍。進一步研究發(fā)現(xiàn)［13］，有時候晶種的引入是通過改變結(jié)晶母液的化學(xué)位移引起晶體的生長，而不是晶種本身引發(fā)晶體的生長;某些條件下通過引晶能產(chǎn)生小而多的晶體。這些結(jié)果表明，某些情況下向母液中植入晶種能誘導(dǎo)晶體生長而其他條件下晶種可能不引發(fā)晶體生長。因此，通過改變化學(xué)位移而引起的晶體生長擴大了選中結(jié)晶條件的概率。

2.2 用配體穩(wěn)定蛋白質(zhì)

用配體穩(wěn)定蛋白質(zhì)不僅能使蛋白質(zhì)活性更加穩(wěn)定和更容易結(jié)晶，而且能提高獲得高質(zhì)量單晶的機會。例如，在200個已被結(jié)構(gòu)基因協(xié)會確定的蛋白質(zhì)中，100個結(jié)合配體才能結(jié)晶，約有20個結(jié)合配體后才能進行結(jié)構(gòu)測定［14］。相信在不久的將來，不管小型實驗還是結(jié)構(gòu)基因組學(xué)等大規(guī)模實驗中，用小分子化合物來穩(wěn)定功能蛋白將會越來越普遍。

氨基酸及氨基酸衍生物是其他一類影響蛋白質(zhì)分子熱穩(wěn)定性和折疊性的化合物［15］。Ito等［16］驗證了一些氨基酸(如賴氨酸)和氨基酸衍生物(如甘氨酸乙酯和甘氨酸酰胺)對馬血紅蛋白和牛胰核糖核酸酶A結(jié)晶的影響。向蛋白溶液中添加氨基酸及氨基酸衍生物可以擴大篩選結(jié)晶條件的范圍，這樣能獲得高質(zhì)量的單晶。如DNA解旋酶——DnaB，它在4℃的純化緩沖液中活性僅能保持幾分鐘，但經(jīng)過優(yōu)化后可以在60℃穩(wěn)定數(shù)小時［17］。

2.3 人工誘導(dǎo)成核

有人認為，蛋白質(zhì)晶體大多數(shù)是均質(zhì)生長的。事實上，由于受到微觀雜質(zhì)和不溶聚合體的影響，它們都是核異質(zhì)的［2］?？梢钥隙?，精確控制晶核的數(shù)量和晶核生長的過飽和點有助于形成高質(zhì)量的晶體［18］。誘導(dǎo)非均相成核的方法有很多種，其中包括多孔硅膠在內(nèi)的多孔材料的使用。多孔材料表面含有大量的形狀和大小不同的微孔，給定的大分子能找到形狀和大小匹配的成核孔［19］，這些孔腔是用來“欺騙”蛋白分子，從而促使晶核形成和晶體生長。目前使用較多的多孔材料是一種無定形多孔生物活性玻璃(CaO-P2O5-SiO2)［3，19］，它以直徑約為 100 μm 的顆粒植入待結(jié)晶液滴中。多孔生物玻璃促進成核不需要附加條件，也不受分子質(zhì)量、pH值和沉淀劑的影響［19］。此外，纖維素、羥基磷灰石粉末以及帶孔的一些天然物質(zhì)也成功誘導(dǎo)成核［20］。

2.4 蛋白質(zhì)修飾

分子生物學(xué)方法中，通過取代特殊氨基酸殘基、修飾特定的側(cè)鏈或者合并翻譯后修飾等方式來賦予蛋白質(zhì)結(jié)晶特性。常用的提高蛋白質(zhì)結(jié)晶特性的化學(xué)修飾方法是賴氨酸殘基甲基化的還原［21］，這種方法通過提高甲基化的賴氨酸側(cè)鏈的疏水性來降低蛋白質(zhì)的溶解度。研究表明，有40%的蛋白質(zhì)在甲基化還原后重新獲得結(jié)晶能力［22］。

替代半胱氨酸殘基或還原羧甲基半胱氨酸殘基也是常用的化學(xué)修飾法［23］。半胱氨酸殘基的替換在不影響蛋白功能的前提下，能使更多的蛋白質(zhì)適合結(jié)晶。與賴氨酸修飾相反，羧甲基半胱氨酸殘基的還原能增加蛋白質(zhì)的溶解度，從而防止蛋白的聚合和展開［24］。例如以丙氨酸替代大腸桿菌蛋白RecX(DNA同源重組的調(diào)節(jié)蛋白)中113位和118位半胱氨酸，能夠使RecX結(jié)晶［25］。另一個策略是在暴露于溶劑中的蛋白質(zhì)表面引入半胱氨酸殘基，通過二硫鍵形成人工二聚體，這種二聚體呈現(xiàn)對稱性，對稱的蛋白質(zhì)分子更容易結(jié)晶［26］。通過這種方法形成人工二聚體噬菌體T4溶菌酶，比傳統(tǒng)的氣相擴散方法能多獲得6個新的單晶。人工半胱氨酸二聚體法似乎比較適合于小型蛋白質(zhì)的結(jié)晶［26］。

此外，原位水解也用來修飾蛋白質(zhì)，它的應(yīng)用能成倍增加蛋白質(zhì)結(jié)晶和結(jié)構(gòu)測定的成功率［27］。據(jù)報道，270種以上可溶性蛋白質(zhì)經(jīng)過原位水解，獲得符合結(jié)構(gòu)測定要求晶體的概率增加了約12%［28］。

2.5 生物物理技術(shù)的應(yīng)用

大量的生物物理技術(shù)和方法被用來評價蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性。常用的兩種技術(shù)是發(fā)射熒光光譜和光散射技術(shù)，它們幫助確定能輔助篩選蛋白質(zhì)結(jié)晶的穩(wěn)定條件［29］。前者通過測量熒光的變化來監(jiān)測蛋白質(zhì)的展開或因配體結(jié)合引起的構(gòu)象變化，而動態(tài)光散射可用來測定一個樣本是否適合結(jié)晶［30］。此外，動態(tài)光散射技術(shù)利用光學(xué)顯微鏡可以監(jiān)測由于溫度、pH值、離子強度或添加物引起的蛋白質(zhì)聚集［31］并轉(zhuǎn)變?yōu)榫Ш说倪^程，幫助實驗者鎖定溶液從成核條件到晶體生長條件轉(zhuǎn)變的時間點，在高通量模式的應(yīng)用中，動態(tài)光散射技術(shù)已經(jīng)趨向于小型化和自動化［32］。此外，以熒光為基礎(chǔ)的熱轉(zhuǎn)移測定技術(shù)［33］則在篩選蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件如pH值、添加劑以及緩沖液等方面具有明顯的優(yōu)越性。這些新技術(shù)幫助研究者尋找蛋白質(zhì)的結(jié)晶規(guī)律，摸索結(jié)晶條件，并最終得到高質(zhì)量單晶。

3 展望

盡管近幾年結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究飛速發(fā)展，但蛋白質(zhì)結(jié)晶很大程度上依然是經(jīng)驗科學(xué)。在蛋白質(zhì)可結(jié)晶性的研究中，多數(shù)的研究只是針對幾種常用的蛋白質(zhì)進行，所以當(dāng)用這些技術(shù)篩選其它蛋白質(zhì)結(jié)晶條件時，缺乏普遍的適用性。因此，應(yīng)進一步深入認識蛋白質(zhì)的結(jié)晶規(guī)律，結(jié)合先進的科學(xué)技術(shù)，采用更多的結(jié)晶策略和方法使目標(biāo)蛋白更容易結(jié)晶。

蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)在針對靶標(biāo)蛋白質(zhì)的小分子藥物研究中起到了非常重要的作用。蛋白質(zhì)結(jié)晶可以快速解決蛋白質(zhì)-配體或先導(dǎo)化合物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，幫助人們理解小分子如何與蛋白質(zhì)結(jié)合，并利用其相關(guān)結(jié)構(gòu)信息設(shè)計新的藥物分子［34］。蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)的發(fā)展加速了蛋白質(zhì)藥物的應(yīng)用研究，利用現(xiàn)代生物技術(shù)對生物體分離純化所得的氨基酸類，肽類和蛋白類物質(zhì)進行結(jié)晶后的結(jié)構(gòu)分析，積極的促進了蛋白質(zhì)藥物的開發(fā)研究。

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Progress in techniques on protein crystallization

LIU Si-hua，WANG Qian-qian，XIAO Liang，ZHANG Li-ming
(Department of Chemical Defense Medicine，F(xiàn)aculty of Naval Medicine，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

TQ464.7

A

1005-1678(2011)05-0405-03

2010-07-16

上海市自然科學(xué)基金(10ZR1437900)

劉四化，男，碩士研究生，主要從事海洋生物毒素蛋白分離純化研究;張黎明，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:lmzhang1969@yahoo.com.cn。