小兒腹瀉散微生物限度檢查方法驗證

馬亮英 蔣磊

小兒腹瀉散全方由兒茶、枯礬、半夏、朱砂、五倍子等藥味組成，具有澀腸止瀉之功效，用于小兒腹瀉(水樣便)的有效藥物?，F(xiàn)行收載的檢查項下，沒有規(guī)定具體的微生物限度檢查方法，只采用常規(guī)方法進(jìn)行微生物限度檢查，其結(jié)果不能真實反映其污染的微生物狀況［1］。為此筆者對小兒腹瀉散按《中國藥典》2010年版［2］進(jìn)行了微生物限度方法學(xué)驗證，有效提高了微生物污染檢出率，從而保證檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性的檢驗方法，具體報告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HTY-2000A集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備公司)。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌【CMCC(B)26003】;枯草芽胞桿菌【CMCC(B)63501】;大腸埃希菌【CMCC(B)44102】;白色念珠菌【CMCC(F)98001;】;黑曲霉菌【CMCC(F)98003】

1.3 培養(yǎng)基 改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、膽鹽乳酸增菌液、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)

1.4 供試品 小兒腹瀉散由新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液及供試液制備 取經(jīng)(32.5±2.5)℃培養(yǎng)18～24 h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌肉湯液體培養(yǎng)物1 ml加入9 ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7，為50～100cfu/ml，備用。另取經(jīng)(25.5±2.5)℃培養(yǎng)18～24 h，白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 ml加入9 ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5，備用。另取經(jīng)25℃培養(yǎng)一周的黑曲霉菌斜面培養(yǎng)物，加入0.9%氯化鈉溶液5 ml，洗下孢子，轉(zhuǎn)移至另一空管中，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，與濁度相當(dāng)后，取1 ml加入9 ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-4，為50～100cfu/ml，備用。

2.2 供試液制備 取供試品制成濃度均為1∶10供試液后，用離心機(jī)(500r/min，3 min)離心，取上清液作為供試液。

2.3 回收率測定

2.3.1 細(xì)菌、霉菌和酵母菌用常規(guī)法預(yù)試驗測定 取供試液1 ml和已制備好的上述5種代表試驗菌株1 ml分別注入平皿中。加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌的試驗平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，30～35℃培養(yǎng)3 d，計數(shù);加入白色念珠菌、黑曲霉菌的試驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，23～28℃培養(yǎng)5 d，計數(shù);每株試驗菌平行制備2各平皿。結(jié)果該供試品對大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率＞70%，對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌的抑制作用較強(qiáng)。選擇合適方法消除其在檢驗條件下對后兩種菌的抑制作用，提高微生物的檢出率。

2.3.2 用培養(yǎng)基稀釋法測定 取1∶10供試液1 ml等量分注5個平皿，1 ml試驗菌同時加入平皿中，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)3 d，計數(shù)。結(jié)果回收率＜70%，說明采用培養(yǎng)基稀釋法無法消除該供試品的抑菌活性，擬采用薄膜過濾法進(jìn)行測定。

2.3.3 用薄膜過濾法測定 取1∶10供試液10 ml，加入pH 7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液至100 ml，混勻，過濾。每只濾筒用pH 7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液100 ml，沖洗共3次，陽性對照在最后一次沖洗時分別加入1 ml試驗菌，沖洗后取出濾膜，貼膜法測定，30～35℃培養(yǎng)3 d，計數(shù)。采用薄膜過濾貼膜法，沖洗量為每桶300 ml進(jìn)行測定，結(jié)果回收率＞70%，說明采用薄膜過濾貼膜法可消除該供試品的抑菌活性。

2.4 控制菌檢查方法的驗證 大腸埃希菌和大腸菌群可采用常規(guī)法進(jìn)行檢查;沙門菌可采用常規(guī)法進(jìn)行檢查。

3 討論

通過驗證小兒腹瀉散不能按常規(guī)法檢查微生物限度，進(jìn)行微生物限度檢查時先降低消除其抑菌作用，采用常規(guī)法檢查小兒腹瀉散中的霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌;用薄膜過濾法檢查細(xì)菌數(shù)，該方法檢測得到最高的回收率，結(jié)果可靠。此法與培養(yǎng)基稀釋法比較，具有使用平皿少、易清洗、熟練后操作簡便易行的特點。

［1］耿敬軍，張俊.藥品微生物檢查驗證試驗現(xiàn)狀調(diào)查與建議.中國藥房，2006，17(21):1652.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:附錄 79-86.