飼料中添加復(fù)方中草藥對(duì)史氏鱘肝臟保護(hù)作用的研究

張盈嬌 夏陳 曾曉丹 朱宇 王娟 鐘振東

史氏鱘（Acipenser schrenscki Brandt）為鱘形目，鱘科，鱘屬，是中國現(xiàn)存鱘魚中最具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)珍稀魚類，在黑龍江、烏蘇里江、松花江等流域均有分布。但隨著養(yǎng)鱘業(yè)集約化、規(guī)?；陌l(fā)展，史氏鱘肝臟疾病逐漸增多，尤以脂肪肝和肝性腦病最為嚴(yán)重，影響其生長(zhǎng)、肉質(zhì)和抗病能力，嚴(yán)重時(shí)可造成繼發(fā)傳染性疾病的暴發(fā)，死亡率達(dá)50%以上。目前廣泛采用抗生素類藥物治療這類疾病，抗生素起效快，但副作用較大，易產(chǎn)生抗藥性。中藥制劑由于具有毒副作用小、病原體不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)越來越受重視，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上的應(yīng)用日益廣泛。本實(shí)驗(yàn)選用4種中草藥復(fù)方制劑，以史氏鱘幼魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定并分析其生長(zhǎng)指標(biāo)、血液相關(guān)生化指標(biāo)、肝臟組織病理變化，研究中草藥復(fù)方制劑對(duì)史氏鱘肝臟的保護(hù)作用，為中草藥防治史氏鱘肝臟疾病的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚與飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)魚取自成都日興特種水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中心當(dāng)年繁殖的幼魚,體重（11.66±0.56）g。實(shí)驗(yàn)在玻璃纖維養(yǎng)殖缸中進(jìn)行，養(yǎng)殖缸規(guī)格為57 cm×50 cm×40 cm，水源為曝氣后的自來水，保持微流水，供水量為0.5～1 L/min，水溫（18±1）℃，溶解氧(8.74±1.54)mg/l，pH值（6.94±0.25）。實(shí)驗(yàn)分5組，編號(hào)1、2、3、4、5，分別為復(fù)方制劑1、2、3、4組和空白對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)平行養(yǎng)殖缸，每個(gè)養(yǎng)殖缸飼養(yǎng)15尾魚。實(shí)驗(yàn)前將史氏鱘在養(yǎng)殖缸中馴養(yǎng)7 d。正式實(shí)驗(yàn)開始后，以5 g/kg基礎(chǔ)飼料的比例添加各復(fù)方，第5組不添加。飼料日投喂率為魚體重的2%，撒布投喂，每10 d調(diào)整一次投喂量,實(shí)驗(yàn)期50 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

基礎(chǔ)飼料：魚苗專用微粒子配合飼料，由山東升索漁用飼料研究中心提供（批號(hào)：20090312）；復(fù)方1由絞股藍(lán)、水飛薊等組成；復(fù)方2由黃芪、黨參、當(dāng)歸、澤瀉等組成；復(fù)方3由茵陳、大黃、郁金、連翹等組成；復(fù)方4由山藥、黃芩等組成。所有中藥材均購于成都荷花池中藥材專業(yè)批發(fā)市場(chǎng)。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，待魚空腹24 h后稱魚體重。從每個(gè)養(yǎng)殖缸中隨機(jī)抽取10尾魚，每組取30尾，逐尾稱體重，量體長(zhǎng)后尾靜脈取血，加肝素抗凝，離心10 min（4 000 r/min），收集上層血清樣品冷藏待用，使用美國雷杜公司生產(chǎn)的RT-1904C自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清生化指標(biāo)的分析。并取出肝臟組織，進(jìn)行肝細(xì)胞HE染色,Olympus IX70光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

增重率(%)=(末質(zhì)量-初質(zhì)量)/初質(zhì)量×100；

相對(duì)生長(zhǎng)率(%/d)=[(末質(zhì)量-初質(zhì)量)/初質(zhì)量/實(shí)驗(yàn)天數(shù)]×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），如有顯著差異（P＜0.05），則作Duncan's法多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中草藥對(duì)史氏鱘生長(zhǎng)的影響（見表1）

從表1可知，50 d后各組實(shí)驗(yàn)魚的末質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)前相比均有大幅度增加，1、3、4組的增重率顯著高于第5組（P＜0.05），分別比第5組高50.99%、32.79%、10.82%；1、3組相對(duì)生長(zhǎng)率顯著高于第5組（P＜0.05），分別比第5組高39.32%和32.91%，2、4、5組間相對(duì)生長(zhǎng)率無顯著差異（P＞0.05）。

表1 復(fù)方中草藥對(duì)史氏鱘幼魚生長(zhǎng)指標(biāo)的影響（n=3；X±SD）

2.2 復(fù)方中草藥對(duì)史氏鱘血清生化指標(biāo)的影響（見表2）

由表2可知，1～3組的血清膽固醇(CHOL)含量顯著低于第5組(P＜0.05)，1、3組的甘油三酯(TG)含量顯著低于第5組(P＜0.05)，1組的CHOL和TG含量最低，分別為（1.73±0.16）mmol/l和（6.24±0.42）mmol/l，分別比5組低27.62%和25.00%，2、4組間及4、5組間CHOL含量均無顯著差異(P＞0.05)，1、3組間，2、4、5組間TG含量無顯著差異(P＞0.05)；1、3組間血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性無顯著差異(P＞0.05)，分別為（91.86±5.64）mmol/l和（88.67±5.73）mmol/l，顯著低于其他組(P＜0.05)，分別比5組降低了24.78%和27.39%，2、4組間及4、5組間ALT活性無顯著差異(P＞0.05)；1～4組的天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性均顯著低于第5組(P＜0.05)，其中3組的AST活性最低，比第5組低31.51%，第3組的AST活性顯著低于其他組(P＜0.05)，2、4組間無顯著差異(P＞0.05)；1、2、3組的乳酸脫氫酶(LDH-L)活性顯著低于第5組(P＜0.05)，分別比第5組降低了11.61%、10.49%和8.73%，1、2組間及4、5組間無顯著差異(P＞0.05)；1～3組高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均顯著高于第5組(P＜0.05)，分別比第5組高32.76%、18.23%、33.74%,1、3組間無顯著差異(P＞0.05)；1～4組的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量均顯著高于第5組(P＜0.05)，分別比第5組高18.77%、13.33%、23.70%和10.37%，其中第3組最高，1、2、4組間無顯著差異(P＞0.05)。

表2 復(fù)方中草藥對(duì)史氏鱘幼魚血清生化指標(biāo)和肝臟組織病理學(xué)的影響（n=3±SD）

表2 復(fù)方中草藥對(duì)史氏鱘幼魚血清生化指標(biāo)和肝臟組織病理學(xué)的影響（n=3±SD）

項(xiàng)目膽固醇(mmol/l)甘油三酯(mmol/l)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(U/l)天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(U/l)乳酸脫氫酶(U/l)高密度脂蛋白膽固醇(mmol/l)低密度脂蛋白膽固醇(mmol/l)肝細(xì)胞脂肪性病變?cè)u(píng)分1 1.73±0.16a 6.24±0.42a 91.86±5.64a 810.18±25.12a 1 553.55±35.63a 5.39±0.41a 4.81±0.50ab 0.67±0.62a 2 1.87±0.15ab 7.37±0.79b 103.66±9.10b 880.53±25.24b 1 573.18±36.68a 4.80±0.29b 4.59±0.27b 1.13±0.99ab組別3 1.79±0.15a 6.26±0.50a 88.67±5.73a 740.62±13.21c 1 604.14±26.67b 5.43±0.42a 5.01±0.17a 0.73±0.59a 4 2.19±0.39bc 7.87±0.95b 111.75±9.00bc 896.23±14.25b 1 778.46±33.42c 4.15±0.37c 4.47±0.28b 1.47±0.92bc 5 2.39±0.49c 8.32±1.15b 122.12±12.60c 1 081.34±34.47d 1 757.64±31.99c 4.06±0.23c 4.05±0.22c 2.07±0.96c

2.3 各實(shí)驗(yàn)組史氏鱘肝臟組織病理學(xué)變化（見圖1）

取各實(shí)驗(yàn)組史氏鱘的肝組織，中性甲醛固定，石蠟切片HE染色，200倍光鏡下每張切片選擇5個(gè)染色均勻的高倍視野(200個(gè)細(xì)胞/視野)，觀察肝臟組織病理學(xué)改變。肝小葉內(nèi)脂肪沉著面積計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：按肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)之比值為0，計(jì)分0；比值＜1/3，計(jì)分1；比值為1/3～2/3，計(jì)分為2；比值＞2/3，計(jì)分3；比值≈1，計(jì)分4(結(jié)果見圖1、表2)。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組史氏鱘HE染色肝組織病理改變（×200）

1、2、3組的脂肪性病變?cè)u(píng)分均顯著低于第5組(P＜0.05)，其中第1、3組最低，兩組間無顯著差異(P＞0.05)。1、3組：組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞排列較空白對(duì)照組有序致密，細(xì)胞內(nèi)空泡（脂肪滴）少見，也未見炎性細(xì)胞聚集。2組：結(jié)構(gòu)尚緊密，肝細(xì)胞間隙較大，細(xì)胞胞漿內(nèi)散在空泡（脂肪滴），伴有少量匯管區(qū)炎性細(xì)胞。4組：肝組織結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，細(xì)胞間質(zhì)成分減少，脂肪變性改變，可見較多大小空泡（脂肪滴），伴有匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。5組：肝細(xì)胞排列較紊亂，肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)大于2/3，脂變肝細(xì)胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加，胞質(zhì)內(nèi)充滿大量脂肪空泡，匯管區(qū)和小葉內(nèi)可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥對(duì)史氏鱘生長(zhǎng)的影響

中草藥可以保護(hù)養(yǎng)殖魚的肝臟，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)，一方面原因是中草藥富含的皂苷、氨基酸、生物堿等物質(zhì)可增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的肝臟功能，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)代謝；另一方面，中草藥具有獨(dú)特的味道,可能對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有誘食作用。本研究中，飼料中添加復(fù)方制劑1、3能不同程度地促進(jìn)史氏鱘生長(zhǎng)，復(fù)方制劑2、4效果不顯著?？赡苁且?yàn)閺?fù)方制劑2、4中的某些藥物與史氏鱘的味覺感受器不一致，或者是由于復(fù)方制劑2、4中用藥或用量不妥，導(dǎo)致史氏鱘生長(zhǎng)速度較其他藥物組慢。

3.2 復(fù)方中草藥對(duì)史氏鱘血清生化指標(biāo)的影響

魚血清中膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）的含量可間接地反映脂類在肝臟中的代謝情況。LDL-C是將CHOL從肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)到血液的主要脂蛋白，而HDL-C是將肝臟外組織細(xì)胞中過剩的CHOL轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟的脂蛋白，從而維持肝臟和血液中的脂肪代謝平衡。當(dāng)魚肝臟發(fā)生肝臟病變時(shí)，脂蛋白的合成能力不足，肝細(xì)胞中的脂肪不能及時(shí)運(yùn)出，就會(huì)造成脂肪在肝臟和血液中積聚，血清中CHOL、TG的含量升高。劉偉等的研究表明,CHOL、TG的升高可導(dǎo)致中華鱘幼魚生長(zhǎng)異常。本研究結(jié)果顯示，飼料中添加復(fù)方1～3可促進(jìn)史氏鱘血清中HDL-C和LDL-C的合成，使CHOL和TG的含量降低，加快血液和肝臟組織細(xì)胞中CHOL和TG的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少肝臟中脂肪的積聚，防止肝臟的脂肪性病變。

另外，魚血清中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH-L)等酶類主要分布于肝和腎等組織細(xì)胞中，當(dāng)魚的肝臟發(fā)生病變時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)酶大量逸出,導(dǎo)致血清中酶類活性顯著增強(qiáng)。已有的研究表明，在魚飼料中添加中草藥,魚體血清中ALT和AST的濃度都不同程度地得到了降低，這對(duì)于保護(hù)肝臟有明顯的作用。本研究中，與空白對(duì)照組比較，飼料中添加復(fù)方1～3可顯著降低血清中上述三種酶的活性，說明復(fù)方1～3能夠增強(qiáng)史氏鱘肝細(xì)胞的活性，保護(hù)肝臟，間接增強(qiáng)史氏鱘的抗病能力。

3.3 復(fù)方中草藥對(duì)史氏鱘肝臟的組織形態(tài)的影響

本研究中，HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的肝細(xì)胞排列較紊亂、腫脹，肝小葉內(nèi)脂肪含量較高，有較嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于空白對(duì)照組，復(fù)方1～3能使肝臟脂肪性病變和炎癥減輕,說明復(fù)方1～3可促進(jìn)史氏鱘肝臟的脂類代謝，提高肝細(xì)胞的再生修復(fù)功能。其中1、3組效果最佳，第4組效果不顯著。

綜上所述，相對(duì)于空白對(duì)照組，復(fù)方1、3對(duì)史氏鱘肝臟的保護(hù)作用最佳，復(fù)方2次之，復(fù)方4效果不顯著。說明所選用的幾種復(fù)方中藥對(duì)史氏鱘生長(zhǎng)指標(biāo)、血液相關(guān)生化指標(biāo)或肝臟組織具有一定的調(diào)節(jié)作用，其中有效成分和機(jī)理有待將來繼續(xù)研究。復(fù)方中草藥作為史氏鱘保護(hù)肝臟的藥品，其成本低廉、簡(jiǎn)便易行，功效顯著，在實(shí)際生產(chǎn)中有一定的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。