• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    靈桿菌非特異性核酸酶的原核表達、純化及活性分析

    2011-02-09 09:31:28陳鵬楊海艷李慧婧楊龍雨李學俊
    生物工程學報 2011年8期
    關鍵詞:核酸酶核酸水解

    陳鵬,楊海艷,李慧婧,楊龍雨,李學俊

    西北農林科技大學生命科學學院,楊凌 712100

    重組蛋白質表達技術的成熟與發(fā)展為研究蛋白質的結構與功能提供了高效的研究手段,同時重組表達技術為眾多蛋白質與酶的大規(guī)模制備和應用奠定了基礎。但目前在重組蛋白特別是醫(yī)用重組蛋白純化過程中還面臨諸多問題,如菌體釋放的核酸會產生高粘度的裂解液進而影響下游的操作和層析純化,同時過量的核酸將導致純化產品的核酸污染等。核酸的污染也會影響到純化過程蛋白的定量以及活性分析甚至影響蛋白的結晶?,F(xiàn)今最常用的核酸去除方法利用了核酸帶負電荷的特征,在初步純化時利用如STREAMLINE SP、SP Sepharose Big Beads、SP或CM Sepharose FF、SP Sepharose XL等離子交換介質除去大量核酸,也有研究利用疏水層析介質去除核酸。但以上方法成本較高,需要昂貴的儀器設備,不適合純化前期大規(guī)模的核酸去除。酶催化的高效性使酶法去除核酸成為理想的途經,已有通過加入核酸酶去除蛋白樣品中核酸的研究實例。如商業(yè)化產品 Benzonase endonuclease、DNase和RNase A等,其中Benzonase endonuclease來源于靈桿菌。靈桿菌核酸酶 (Serratia marcescens nuclease,smNU) 是一種分泌至胞外的非特異性磷酸二酯酶,其在金屬陽離子存在下可以高效切割任意形式的核酸 (DNA和RNA,雙鏈和單鏈)[1-5],其催化效率是葡萄球菌核酸酶的4倍,牛胰DNase I的34倍。靈桿菌是一種條件致病菌,致使大規(guī)模培養(yǎng)菌液用于核酸酶的分離純化存在潛在的危險,因此有必要探索該酶安全高效的重組表達體系。由于核酸酶的胞內表達可能造成重組表達宿主細胞自身核酸的降解而產生宿主細胞的強毒性,因此已報道的 smNU重組表達均采用胞外分泌的方式,但表達效率較低,每升僅可生產1.23×104U的酶[6]。本研究在成功克隆了 smNU基因的基礎上,構建了smNU的胞內原核表達載體,實現(xiàn)了該酶的胞內高效表達,并用Amylose resin純化該酶得到了理想的純化效果,為今后smNU的分子改造以及應用奠定了基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種與質粒

    經鑒定的靈桿菌為本實驗室保存,大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。pMAL-c4X載體為New England Biolabs公司產品,其分子大小為6 645 bp,編碼麥芽糖結合蛋白的片段大小為1 388 bp。

    1.1.2 工具酶和主要試劑

    實驗用到的限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、蛋白分子質量Marker均購自Fermentas公司。Pfu Turbo DNA聚合酶為 Stratagene公司產品。DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司。其他常用生化及分子生物學試劑均為國產或進口分析純。Amylose resin為NEB公司產品。引物合成及測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 靈桿菌核酸酶原核表達載體的構建

    根據(jù)smNU的基因序列設計并合成引物。上游引物 NU12-1: 5′-GCCGACACGCTCGAATCCAT C-3′,下游引物 NU12-2: 5′-AGTCGGATCC TCAG TTTTTGCAGCCCATCAACTCC-3′,下游引物引入BamHⅠ的酶切位點 (下劃線所示)。以靈桿菌的基因組DNA為模板,進行PCR擴增。PCR反應體系為 (25 μL):1×PCR緩沖液,2 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,75 ng靈桿菌基因組DNA,200 nmol/L上下游引物,1 U Pfu Turbo DNA聚合酶。PCR反應參數(shù)為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 20 s,61 ℃30 s,72 ℃ 1 min ,25個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。 PCR產物采用 PCR產物回收試劑盒純化后進行BamHⅠ酶切,質粒 pMAL-c4X采用 XmnⅠ和BamHⅠ雙酶切,膠回收大片段后進行連接,連接產物轉入E. coli BL21。經菌落PCR驗證為陽性的克隆,提取質粒送北京奧科生物技術有限責任公司進行測序鑒定。

    1.2.2 序列分析

    將測序所得的序列在 NCBI網站 (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast),采用 BLASTN軟件進行相似性搜索,核酸序列同源性比較用ClustalX2程序進行分析。

    1.2.3 MBP-NU融合蛋白的誘導表達

    將構建正確的重組質粒pMAL-c4X-NU轉入E. coli BL21,37 ℃培養(yǎng)7 h后,用于擴大培養(yǎng)。

    1) 誘導溫度和IPTG濃度對MBP-NU融合蛋白表達量的影響:將擴大培養(yǎng)的菌液按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基中,分別置于24 ℃、28 ℃、37 ℃培養(yǎng)至菌濃度OD600值為1.0時,分別加入IPTG至終濃度為0.5、0.75、1.0 mmol/L,誘導培養(yǎng)3 h,收獲細菌培養(yǎng)物,SDS-PAGE分析表達情況,分離膠濃度為12.5%。

    2) 誘導時間對 MBP-NU融合蛋白表達量的影響:將擴大培養(yǎng)的菌液按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至菌濃度OD600值為1.0時,加入IPTG至終濃度為0.75 mmol/L,誘導時間分別為0.5、1.5、2.5和3.5 h,收獲細菌培養(yǎng)物,SDS-PAGE分析表達結果。

    1.2.4 融合蛋白的純化

    融合蛋白的純化參考NEB公司pMAL試劑盒說明進行[7]。將擴大培養(yǎng)的菌液按 1∶100接種于250 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至菌濃度OD600值為1.0時,加入IPTG至終濃度為0.75 mmol/L,誘導培養(yǎng)2 h后,8 000 r/min離心10 min并將收獲的菌體重懸于40 mL的裂解液 (10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.2) 中,?20 ℃放置過夜后,冰浴條件下超聲破碎20 min,超聲功率為30 W,超聲間隔時間為10 s,裂解的菌液12 000 r/min離心10 min,收集上清備用。用8倍柱體積的平衡緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.2) 平衡Amylose resin親和層析柱,然后加入樣品并使其緩慢的流過層析柱以便樣品充分的結合,用 10倍柱體積的洗滌緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl,1 mol/L NaCl,pH 7.2) 洗去未結合的蛋白,最后用洗脫緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L麥芽糖,pH 7.2) 洗脫,洗脫蛋白用SDS-PAGE進行分析,蛋白的純度采用Bandscan軟件進行分析。

    1.2.5 MBP-NU融合蛋白的活性檢測

    以 10 kb的標準質粒為底物,不同單位的MBP-NU對其進行水解反應。酶活單位的定義:在37 ℃條件下30 min完全降解5 μg DNA的酶量為一個酶活單位。在冰浴上每支PCR管中加入3 μL緩沖液N (250 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl,0.5 g/L BSA,5 mmol/L MgSO4),過量的標準質粒,一定量的MBP-NU,用ddH2O補充至終體積為15 μL,混勻,37 ℃保溫30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應結果。MBP-NU的量分別為:0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 U。

    以含 RNA的 10 kb標準質粒為底物,進行MBP-NU降解 RNA的定性實驗。反應體系:3 μL緩沖液N,過量的標準質粒,適量的MBP-NU,再加入ddH2O至終體積15 μL,混勻,37 ℃保溫30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應結果。MBP-NU的量分別為:0、8、16、24、32、40、48、56 U。

    1.2.6 EDTA和PMSF對MBP-NU活性的影響

    在下述反應體系中分別加入不同濃度的抑制劑EDTA或PMSF,混勻,37 ℃保溫30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應結果。EDTA的濃度分別為:0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L。PMSF的濃度分別為:0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L。反應體系為:3 μL緩沖液N,過量的標準質粒,7.5 U的MBP-NU,適量的抑制劑,再加入ddH2O至終體積15 μL。

    1.2.7 溫度、pH和鹽濃度對MBP-NU活性的影響

    參考1.2.5的方法,分別在0 ℃、4 ℃、16 ℃、24 ℃、37 ℃、52 ℃、67 ℃、82 ℃條件下檢測MBP-NU的水解活性,分析溫度對MBP-NU水解活性的影響。用pH分別為3.7、4.5、5.6、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液替代緩沖液N,在37 ℃條件下檢測MBP-NU的水解活性,分析pH對MBP-NU水解活性的影響。

    為探討鹽濃度對MBP-NU水解活性的影響,參考1.2.5的方法,在反應體系中加入終濃度分別為0、50、100、150、200、250、300 mmol/L KCl或NaCl,37 ℃條件下檢測酶的水解效率。

    1.2.8 純化MBP-NU中蛋白酶活性的檢測

    純化蛋白中蛋白酶活性的測定參考 Cupp-Enyard[8]的方法。滅菌試管加入5 mL 0.65% (W/V)酪蛋白溶液,37 ℃水浴中保溫10 min,加入2 000 U的純化酶液,搖勻后,37 ℃精確反應1 h,然后立即向管內加入5 mL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液以終止反應。37 ℃水浴中繼續(xù)保溫30 min,12 000 r/min離心20 min,取上清在275 nm波長處測定光吸收。以含有高溫滅活酶液的測定管作為對照,每次測定重復3次。

    另外分別以商品化的牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin,BSA) 和本實驗室純化的無機焦磷酸酶 (pyrophosphatase,PPA) 作為反應底物,與10 000 U高劑量的MBP-NU在37 ℃條件下反應24 h后,SDS-PAGE分析BSA和PPA電泳帶型的變化。

    1.2.9 純化MBP-NU與商品化Benzonase的活性比較

    為了比較MBP-NU與商品化的Benzonase的水解效率,參考1.2.5的方法,在反應體系中分別加入終濃度為1.0、10 U的酶,37 ℃條件下檢測酶的水解效率。

    1.2.10 純化MBP-NU的去核酸效果檢測

    采用內標法檢測MBP-NU對核酸的水解效果。本實驗室在無機焦磷酸酶的重組表達與純化實驗中,6 g誘導表達的菌體用15 mL裂解液 (25 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,0.5% Tween20,pH 8.0)進行裂解,取裂解液加入1.2.1中的PCR產物至終濃度為100 ng/μL,再分別添加終濃度為0、1、5、10、15、20 U/mL的MBP-NU,37 ℃條件下反應5 min,置于冰上。取2 μL做模板參考1.2.1擴增參數(shù)及體系檢測內標水解程度。

    2 結果

    2.1 靈桿菌核酸酶原核表達載體的構建

    圖1 NU基因的PCR擴增 (A) 和重組質粒的PCR鑒定 (B)Fig. 1 PCR amplification of NU gene (A) and identification of recombinant vector pMAL-c4X-NU (B). M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of NU gene.

    以靈桿菌的基因組DNA為模板,PCR擴增編碼靈桿菌核酸酶的 DNA片段,電泳分析顯示在750 bp左右有一特異DNA帶 (圖1A),大小與預期結果一致。將擴增產物酶切純化后連接到 pMAL-c4X載體上,得到重組表達載體pMAL-c4X-NU。提取重組表達載體,質粒PCR擴增得到約750 bp的基因片段 (圖1B),與目的序列大小一致,并經測序證實載體構建完全正確。

    2.2 靈桿菌核酸酶的序列分析

    用BLASTN在線軟件對所測NU序列進行同源基因檢索顯示其與 S. marcescens 核酸酶基因的同源性為97%,與Serratia proteamaculans 568的核酸酶基因的同源性為 85%。應用 ClustalX2軟件對其核酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)其與S. marcescens核酸酶基因 (GenBank Accession No. M19495.1) 有22個堿基不同,編碼的氨基酸僅在第12位不同,其他均為同義密碼子的變化 (圖2)。

    圖2 靈桿菌核酸酶NU和與其同源的核酸序列比對Fig. 2 Alignment of nucleic acids between NU and its homologous sequences. The reading frame of the maturation protein was highlighted by gray coating.

    2.3 MBP-NU融合蛋白的誘導表達

    SDS-PAGE結果顯示,經IPTG誘導的含重組表達載體的細菌可大量表達大小約為 78 kDa的新蛋白,而分別含有 pMAL-c4X、pMAL-c4X-NU (未經IPTG誘導) 載體的宿主菌及不含表達載體的宿主菌均不表達該蛋白 (圖 3)。新蛋白的分子量約為78 kDa,與預期值大小一致,說明MBP-NU融合蛋白誘導表達成功。

    2.3.1 誘導溫度和IPTG濃度對MBP-NU融合蛋白表達量的影響

    SDS-PAGE結果顯示 (圖4),在IPTG濃度相同的條件下,融合蛋白的相對表達量隨溫度的升高而增加;在溫度相同的條件下,融合蛋白的相對表達量隨IPTG濃度的不同出現(xiàn)了不同的變化,24 ℃時表達量基本相同,28 ℃時濃度為1.0 mmol/L時的表達量最大,37 ℃時濃度為0.75 mmol/L時的表達量最大。其中在37 ℃時IPTG濃度為0.75 mmol/L的條件下,融合蛋白的相對表達量最高。

    圖3 MBP-NU誘導表達的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the induced expression of recombinant MBP-NU. M: protein marker; 1,3,5: induced BL21/pMAL-c4X-NU, BL21/pMAL-c4X and BL21, respectively; 2,4,6: uninduced BL21/pMAL-c4X-NU, BL21/ pMAL-c4X and BL21, respectively.

    圖4 不同誘導溫度和IPTG濃度對MBP-NU表達量的影響Fig. 4 Effects of temperature and IPTG concentration on the expression of MBP-NU. M: protein marker; 1: uninduced; 2,3,4: induced at 24 °C; 5,6,7: induced at 28 °C; 8,9,10: induced at 37 °C; 2,5,8: induced with 0.5 mmol/L IPTG; 3,6,9: induced with 0.75 mmol/L IPTG; 4,7,10: induced with 1.0 mmol/L IPTG.

    2.3.2 誘導時間對MBP-NU融合蛋白表達量的影響

    SDS-PAGE結果顯示 (圖5),誘導時間在1.5 h時融合蛋白的相對表達量較高。誘導時間超過2.5 h,表達量有所下降。

    2.4 融合蛋白的純化

    將誘導表達的菌體進行超聲破碎后離心,上清液用 Amylose resin進行純化。純化蛋白經SDS-PAGE和 Bandscan軟件分析其純度為 93.8% (圖 6),表明與 MBP融合的靈桿菌核酸酶可通過Amylose resin進行高效的純化,從而避免了多次純化對核酸酶穩(wěn)定性及回收率的影響。

    2.5 MBP-NU融合蛋白的活性檢測

    研究考察了不同活性濃度的 MBP-NU對DNA、RNA的水解能力,如圖7所示。隨著MBP-NU的濃度增加,DNA的濃度由于酶解而減少。當MBP-NU濃度達到10.0 U時,DNA已完全被降解。由圖7B可知,MBP-NU可以完全降解RNA。純化的MBP-NU的比活力為1.11×106U/mg。

    圖5 不同誘導時間對MBP-NU表達量的影響Fig. 5 Effect of induction duration on the expression of MBP-NU. M: protein marker; 1?4: induced for 3.5, 2.5, 1.5, 0.5 h, respectively; 5: uninduced.

    圖6 純化MBP-NU融合蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of purified MBP-NU. M: protein marker; 1: induced; 2: uninduced; 3: purified MBP-NU.

    圖7 MBP-NU的DNase活性 (A) 和RNase活性 (B) 檢測Fig. 7 Assay of the DNase (A) and RNase (B) activity of MBP-NU. (A) 1?12: different concentration of MBP-NU(U): 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 10.0. (B) 1?9: different concentration of MBP-NU (U): 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56; M: DNA marker DL2000.

    2.6 EDTA和PMSF對MBP-NU活性的影響

    研究考察了不同濃度的 EDTA和 PMSF對MBP-NU活性的影響,如圖 8所示,0.5 mmol/L EDTA或1 mmol/L PMSF對MBP-NU的活性幾乎無影響,但EDTA濃度達到1 mmol/L時,約80%的 MBP-NU活性受到抑制。

    2.7 溫度、pH和鹽濃度對MBP-NU活性的影響

    圖8 EDTA (A) 和PMSF (B) 對MBP-NU活性的影響Fig. 8 Effects of EDTA (A) and PMSF (B) on the MBP-NU activity. (A) 1?7: different concentration of EDTA (mmol/L): 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0; 8. control. (B) 1: control; 2?9: different concentration of PMSF (mmol/L): 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 12.5; M: DNA marker DL2000.

    圖9 溫度 (A)、pH (B) 和不同濃度KCl (C) 對MBP-NU活性的影響Fig. 9 Effect of temperature (A), pH (B) and different KCl concentration (C) on the MBP-NU activity. (A) 1: control; 2?9: different temperatures (°C): 0, 4, 16, 24, 37, 52, 67, 82. (B). 1: control; 2?8: different pH: 3.7, 4.5, 5.6, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0. (C) 1: control; 2?8: different KCl concentration (mmol/L): 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300; M: DNA marker DL2000.

    考察了不同溫度、pH和鹽濃度對MBP-NU活性的影響。如圖9A所示,隨著處理溫度的升高,剩余DNA的量由于酶解而呈現(xiàn)先降低后增加的變化趨勢,其中 37 ℃時的濃度最低,說明 MBP-NU的最適溫度為37 ℃;圖9B顯示MBP-NU的最適pH為8.0;圖9C說明,低于150 mmol/L的KCl對 MBP-NU的活性幾乎沒有影響,當KCl濃度為250 mmol/L時開始出現(xiàn)抑制現(xiàn)象,并隨鹽濃度的增加抑制程度也增加。NaCl對MBP-NU的活性影響與KCl相同 (結果未顯示)。

    2.8 純化MBP-NU中蛋白酶活性的檢測

    以酪蛋白為底物未檢測到純化的MBP-NU中存在蛋白酶活性。分別以一定純度的BSA和PPA為底物,與10 000 U大劑量純化的MBP-NU長時間保溫后的電泳結果顯示,BSA和PPA樣品的電泳帶型無變化 (圖 10),進一步證明本實驗純化的 MBP-NU中沒有蛋白酶活性。

    2.9 純化MBP-NU與商品化Benzonase的活性比較

    純化的MBP-NU與商品化的Benzonase進行核酸的水解比較顯示,在相同的酶量下,兩種酶對核酸的水解效率相同 (圖11)。

    圖10 純化MBP-NU與PPA和BSA保溫24 h對電泳譜帶的影響分析Fig. 10 Effect of co-incubation of MBP-NU with PPA or BSA for 24 h on the SDS-PAGE bands patterns. M: protein marker; 1,2: PPA; 3,4: BSA; 1,3: control; 2,4: MBP-NU treatment. Arrows indicated the added MBP-NU.

    圖11 純化MBP-NU與商品化Benzonase的活性比較Fig. 11 Activity comparison between MBP-NU and Benzonase. M: DNA marker DL2000; 1: control; 2: Benzonase 1.0 U; 3: MBP-NU 1.0 U; 4: Benzonase 10 U; 5: MBP-NU 10 U.

    2.10 純化的MBP-NU除核酸效果檢測

    結合靈敏的PCR檢測技術,采用內標法對加入的內標片段的水解程度進行檢測,結果顯示 (圖12),伴隨MBP-NU濃度的增加,目標產物的擴增量逐漸降低,當酶量超過20 U/mL時,目的條帶完全消失,說明MBP-NU對于菌體裂解液中的模板有很高的水解效率。

    圖12 不同濃度MBP-NU對菌體裂解液中內標基因NU PCR擴增的影響Fig. 12 Effect of MBP-NU treatment on the PCR amplification of internal reference gene NU in cell lysis. M: DNA marker DL2000; 1?6: different concentration of MBP-NU (U): 0, 1, 5, 10, 15, 20; 7: PCR product from 1.2.1.

    3 討論

    對靈桿菌核酸酶的分泌途經、進化和作用機制已有較多的研究報道[9-12]。靈桿菌核酸酶的催化高效性使其在生物技術和實際生產中的應用價值不斷凸顯,特別是該酶在消除核酸污染方面的顯著效果[13]。由于核酸酶本身對宿主細胞會造成強的毒害作用,從而給該酶的重組表達帶來了很大困難。已有研究報道利用大腸桿菌分泌表達該酶,但由于原核分泌系統(tǒng)的局限性,使其表達量僅達到1.23×104U/L[6]。本研究克隆了靈桿菌的核酸酶基因,序列分析表明,其與報道的S. marcescens 核酸酶基因、Serratia proteamaculans 568的核酸酶的同源性分別為97%和85%。嘗試利用分泌型原核表達載體pLLP-OmpA和pET22b表達該基因,但由于微量的胞內本底表達使菌體生長嚴重受抑或者死亡。

    本研究構建了MBP-NU融合蛋白胞內原核表達載體,在對多個菌種進行篩選的基礎上,實現(xiàn)了其在大腸桿菌胞內的成功表達和表達條件優(yōu)化,菌體生長正常,表達量高達 1.21×107U/L。對于該酶在胞內的可溶性表達為何沒有造成宿主細胞的死亡,推測原因主要有以下兩個方面:一是靈桿菌核酸酶與麥芽糖結合蛋白融合表達,有助于減少其在菌體內對宿主菌的毒害;二是已有研究通過點突變的方式證明二硫鍵是靈桿菌核酸酶發(fā)揮催化活性所必需的[14],由于胞內的氧化還原條件抑制了二硫鍵的形成,使酶在胞內無水解活性,因此不影響細胞的正常生長,當細胞破碎后,外界的氧化條件促使其向有活性的形式轉化。另外本研究中曾轉化構建的表達載體于有利于二硫鍵形成的菌株 Rosetta gami2 (DE3),未有轉化菌落形成,同時發(fā)現(xiàn)該酶僅在個別的菌株中表達,推測可能是由于不同菌株細胞內部氧化還原狀態(tài)的差異使二硫鍵的形成存在巨大的差異,其內在的真正原因有待進一步揭示和證實。

    重組酶對核酸的水解實驗證明重組核酸酶在不切除MBP的情況下仍具有降解DNA和RNA的活性,最適反應條件為37 ℃、pH 8.0,蛋白純化時緩沖液中常用的添加物0.5 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF對MBP-NU的活性幾乎無影響,低于150 mmol/L 的KCl或NaCl (結果未顯示) 對融合蛋白MBP-NU的活性亦無影響。純化的MBP-NU中未檢測到蛋白酶活性,且該酶具有很好的儲存穩(wěn)定性,4 ℃條件下儲存2個月酶活性幾乎沒有變化,其水解效率與商品化Benzonase相同。Marcin等報道細菌裂解液中添加 25 U/mL (約 25 ng/mL) 的Benzonase即可滿足蛋白質純化中核酸去除的需要,在濃度為9 U/mL時,4 h可使99%的放射性標記的核酸完全水解,可滿足FDA對重組蛋白藥物每次使用劑量不得超過10 pg核酸污染的需求[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)表達MBP-NU菌體的裂解液粘稠度明顯低于對照菌。本實驗室在無機焦磷酸化酶的重組表達與純化實驗中,向含有6 g菌體的15 mL裂解液中添加終濃度為10 U/mL (約10 ng/mL) 的MBP-NU,裂解菌體的粘度在5 min內明顯下降,結合PCR高靈敏度的檢測極限,采用內標法證明,當酶濃度達到20 U/mL時,在5 min內即可使作為內標的DNA模板降解至PCR無法檢測到的水平。以上結果說明該酶具有極高的核酸水解效率,在核酸去除中具有添加酶蛋白量少的顯著特征。

    本研究建立了靈桿菌核酸酶的高效胞內重組表達體系,其表達量遠遠高于已有的分泌重組表達系統(tǒng),融合MBP的核酸酶具有很高的水解效率,這些結果為在蛋白純化中利用酶法低成本地去除核酸奠定了基礎。

    REFERENCES

    [1] Muro-Pastor AM, Flores E, Herrero A, et al. Identification, genetic analysis and characterization of a sugar-non-specific nuclease from the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Mol Microbiol, 1992, 6(20): 3021?3030.

    [2] Rangarajan ES, Shankar V. Sugar non-specifc endonucleases. FEMS Microbiol Rev, 2001, 25(5): 583?613.

    [3] Li L, Lin S, Yanga F. Functional identification of the non-specific nuclease from white spot syndrome virus. Virology, 2005, 337(2): 399?406.

    [4] Meiss G, Gast FU, Pingoud AM. The DNA/RNA non-specific Serratia nuclease prefers double-stranded A-form nucleic acids as substrates. J Mol Biol, 1999, 288(3): 377?390.

    [5] Chen C, Krause K, Pettitt BM. Advantage of being a dimer for Serratia marcescens endonuclease? J Phys Chem B, 2009, 113(2): 511?521.

    [6] Kim WY, Lee HS, Suh SY, et al. Purification and cellular localization of extracellular nuclease of Serratia marcescens expressed in Escherichia coli. Kor J Microbiol, 1994, 32(2): 147?154.

    [7] Cattoli F, Boi C, Sorci M, et al. Adsorption of pure recombinant MBP-fusion proteins on amylose affnity membranes. J Membrane Sci, 2006, 273(1/2): 2?11.

    [8] Cupp-Enyard C. Sigma’s non-specific protease activity assay-casein as a substrate. J Vis Exp, 2008, 17(19): 899.

    [9] Sch?fer P, Scholz SR, Gimadutdinow O, et al. Structural and functional characterization of mitochondrial EndoG, a sugar non-specifc nuclease which plays an important role during apoptosis. J Mol Biol, 2004, 338(2): 217?228.

    [10] Miller MD, Cai JW, Krause KL. The active site of Serratia endonuclease contains a conserved magnesium-water cluster. J Mol Biol, 1999, 288(5): 975?987.

    [11] Lunin VY, Levdikov VM, Shlyapnikov SV, et al. Three-dimensional structure of Serratia marcescens nuclease at 1.7? resolution and mechanism of its action. FEBS Lett, 1997, 412(1): 217?222.

    [12] Shlyapnikov SV, Lunin VV, Blagova EV, et al. X-ray analysis of the magnesium-containing endonuclease from Serratia marcescens. Russ J Bioorg Chem, 2001, 27(6): 370?377.

    [13] Benedik MJ, Strych U. Serratia marcescens and its extracellular nuclease. FEMS Microbiol Lett, 1998, 165(1): 1?13.

    [14] Ball TK, Suh Y, Benedik MJ. Disulfide bonds are required for Serratia marcescens nuclease activity. Nucl Acids Res, 1992, 20(19): 4971?4974.

    [15] Olszewski M, Filipkowski P. Benzonase-possibility of practical application. Postepy Biochem, 2009, 55(1): 21?24.

    猜你喜歡
    核酸酶核酸水解
    粘質沙雷氏菌全能核酸酶的研究進展
    測核酸
    中華詩詞(2022年9期)2022-07-29 08:33:50
    全員核酸
    中國慈善家(2022年3期)2022-06-14 22:21:55
    第一次做核酸檢測
    快樂語文(2021年34期)2022-01-18 06:04:14
    核酸檢測
    中國(俄文)(2020年8期)2020-11-23 03:37:13
    含季銨鹽的芳酰腙配體的銅 (Ⅱ)配合物的合成和表征:體外DNA鍵合和核酸酶活性
    多種Cas12a蛋白變體能識別不同的PAM序列(2020.4.27 Plant Biotechnology Journal)
    番石榴中結合多酚堿水解與酸水解法提取工藝優(yōu)化的比較
    用megaTAL 核酸酶對原代人T 細胞CCR5 基因座進行有效修飾可建立HIV-1 抵抗力
    鹽類的水解考點探究
    中學化學(2016年2期)2016-05-31 05:27:22
    久久精品国产亚洲网站| 亚洲国产色片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产精品蜜桃在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品久久久久久av不卡| 国精品久久久久久国模美| 在线观看美女被高潮喷水网站| 青春草亚洲视频在线观看| 色哟哟·www| 午夜激情久久久久久久| 777米奇影视久久| 色吧在线观看| 精品一区二区免费观看| 桃花免费在线播放| 免费播放大片免费观看视频在线观看| av播播在线观看一区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 交换朋友夫妻互换小说| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产永久视频网站| 久久久亚洲精品成人影院| 久久热精品热| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲真实伦在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产有黄有色有爽视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 插逼视频在线观看| 亚洲电影在线观看av| 制服丝袜香蕉在线| av福利片在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 色5月婷婷丁香| 亚洲精品一二三| 一个人看视频在线观看www免费| 黄色配什么色好看| 看免费成人av毛片| 亚洲成色77777| 国产精品一区二区在线观看99| 国产av码专区亚洲av| 纵有疾风起免费观看全集完整版| freevideosex欧美| 欧美日韩在线观看h| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产成人免费观看mmmm| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚州av有码| 2018国产大陆天天弄谢| 伦理电影免费视频| 夫妻午夜视频| 欧美另类一区| 精品少妇久久久久久888优播| 最近中文字幕高清免费大全6| 一二三四中文在线观看免费高清| 午夜福利视频精品| av国产久精品久网站免费入址| 最近手机中文字幕大全| 国产精品99久久99久久久不卡 | 人人妻人人看人人澡| 熟女av电影| 日本-黄色视频高清免费观看| 不卡视频在线观看欧美| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 三级经典国产精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久99精品国语久久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲av男天堂| 777米奇影视久久| 国产视频首页在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 高清欧美精品videossex| 少妇熟女欧美另类| 久久久久久久久久久丰满| 丝袜喷水一区| 免费看不卡的av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日韩欧美 国产精品| 精华霜和精华液先用哪个| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久久久网色| 性色av一级| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 九色成人免费人妻av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久午夜福利片| 99热全是精品| av在线app专区| 两个人免费观看高清视频 | 国产精品欧美亚洲77777| 精品久久国产蜜桃| 久久国产亚洲av麻豆专区| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 国产av一区二区精品久久| 免费看光身美女| 成人毛片60女人毛片免费| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩中文字幕视频在线看片| 国精品久久久久久国模美| 老司机亚洲免费影院| 亚洲图色成人| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 一级二级三级毛片免费看| 午夜福利视频精品| 亚洲精品第二区| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲,欧美,日韩| 大陆偷拍与自拍| 一级,二级,三级黄色视频| 成人国产麻豆网| 午夜激情久久久久久久| 高清不卡的av网站| 一级黄片播放器| 99热这里只有是精品50| 色5月婷婷丁香| 男女免费视频国产| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产男女内射视频| 91精品国产国语对白视频| 熟女人妻精品中文字幕| 内地一区二区视频在线| a级一级毛片免费在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲av成人精品一二三区| 男女边吃奶边做爰视频| 久久97久久精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 丝袜喷水一区| 国产在线视频一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久青草综合色| av女优亚洲男人天堂| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲精品一二三| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日韩中字成人| 成人影院久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 赤兔流量卡办理| 日本黄大片高清| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久久精品94久久精品| 最后的刺客免费高清国语| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲国产精品999| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 深夜a级毛片| 亚洲内射少妇av| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美性感艳星| 插阴视频在线观看视频| 国产精品一二三区在线看| 免费黄频网站在线观看国产| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产在线视频一区二区| 久久久亚洲精品成人影院| 日本wwww免费看| av天堂久久9| 中文字幕av电影在线播放| 免费黄色在线免费观看| 老女人水多毛片| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 大话2 男鬼变身卡| 少妇丰满av| 伦理电影免费视频| 一区二区三区乱码不卡18| 在线观看www视频免费| 免费人成在线观看视频色| 亚洲成色77777| 欧美日韩在线观看h| 男女边吃奶边做爰视频| 一级毛片我不卡| 91精品国产九色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费人妻精品一区二区三区视频| 高清av免费在线| videossex国产| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品不卡视频一区二区| 免费观看av网站的网址| 人人妻人人澡人人看| 精品少妇久久久久久888优播| 国产美女午夜福利| 精品亚洲成国产av| 三级经典国产精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 日韩av免费高清视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美丝袜亚洲另类| 熟女av电影| 精品人妻偷拍中文字幕| 大片电影免费在线观看免费| 国模一区二区三区四区视频| 三上悠亚av全集在线观看 | 日本wwww免费看| 成人漫画全彩无遮挡| 女性被躁到高潮视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产毛片在线视频| 免费观看在线日韩| 99热网站在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 18禁动态无遮挡网站| 国产探花极品一区二区| 久久热精品热| 欧美精品国产亚洲| 一区二区三区乱码不卡18| 天堂俺去俺来也www色官网| 人人妻人人看人人澡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲av.av天堂| videossex国产| 91精品国产九色| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 美女国产视频在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品人妻熟女av久视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| av天堂中文字幕网| 国产精品偷伦视频观看了| 成人特级av手机在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 丁香六月天网| 色网站视频免费| 搡女人真爽免费视频火全软件| 视频中文字幕在线观看| a级毛色黄片| 另类亚洲欧美激情| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 日韩免费高清中文字幕av| 乱人伦中国视频| 成人亚洲欧美一区二区av| www.色视频.com| 国产精品久久久久久av不卡| 中文字幕免费在线视频6| 国产男女超爽视频在线观看| 女人精品久久久久毛片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 麻豆乱淫一区二区| 午夜免费观看性视频| 在线观看av片永久免费下载| 日韩三级伦理在线观看| 春色校园在线视频观看| 国产深夜福利视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品无大码| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 秋霞在线观看毛片| a级片在线免费高清观看视频| 2022亚洲国产成人精品| 少妇的逼好多水| 亚洲精品第二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品欧美亚洲77777| 久久精品国产亚洲网站| 久久av网站| 久久99精品国语久久久| 色视频在线一区二区三区| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲在久久综合| 中文欧美无线码| 国产精品女同一区二区软件| 免费看av在线观看网站| 另类亚洲欧美激情| 国产成人精品久久久久久| 大片电影免费在线观看免费| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 深夜a级毛片| 啦啦啦在线观看免费高清www| 最近手机中文字幕大全| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 日本黄色片子视频| 免费大片黄手机在线观看| 草草在线视频免费看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产熟女欧美一区二区| 精品久久久久久久久av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 赤兔流量卡办理| 亚洲天堂av无毛| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产高清三级在线| 伊人亚洲综合成人网| 精品一区在线观看国产| 国产视频内射| 亚洲中文av在线| 一级毛片 在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 中文资源天堂在线| 观看av在线不卡| 婷婷色综合www| av专区在线播放| 日本午夜av视频| 能在线免费看毛片的网站| 日韩一区二区视频免费看| 日本与韩国留学比较| 91精品国产国语对白视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产永久视频网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜精品国产一区二区电影| 国产高清不卡午夜福利| 丰满人妻一区二区三区视频av| 下体分泌物呈黄色| 日韩一区二区视频免费看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 日日啪夜夜爽| 边亲边吃奶的免费视频| 中国国产av一级| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 天堂中文最新版在线下载| 精品一区在线观看国产| 久热久热在线精品观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 99久久中文字幕三级久久日本| 大香蕉97超碰在线| 日韩成人伦理影院| 看非洲黑人一级黄片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产黄色免费在线视频| 国精品久久久久久国模美| 国产高清三级在线| 婷婷色麻豆天堂久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 精品亚洲成国产av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 综合色丁香网| av在线老鸭窝| 最新的欧美精品一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 丝袜喷水一区| 男女边摸边吃奶| 91久久精品国产一区二区成人| 特大巨黑吊av在线直播| 在线播放无遮挡| 日本黄色日本黄色录像| 国产免费又黄又爽又色| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 精品久久久久久久久亚洲| 日韩中文字幕视频在线看片| 99久久精品国产国产毛片| 另类亚洲欧美激情| 视频区图区小说| 最近2019中文字幕mv第一页| 黄色一级大片看看| 午夜久久久在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 边亲边吃奶的免费视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 欧美精品一区二区免费开放| 插阴视频在线观看视频| a级片在线免费高清观看视频| av免费在线看不卡| 久久精品国产亚洲网站| 高清午夜精品一区二区三区| 久久ye,这里只有精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 高清黄色对白视频在线免费看 | 久久国产精品大桥未久av | 精品视频人人做人人爽| 日本色播在线视频| 我要看黄色一级片免费的| 久久亚洲国产成人精品v| 七月丁香在线播放| 国产日韩欧美视频二区| 欧美日韩综合久久久久久| 男女国产视频网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 中文天堂在线官网| 嫩草影院入口| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一区二区av电影网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 成人漫画全彩无遮挡| 国产日韩欧美在线精品| 深夜a级毛片| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久鲁丝午夜福利片| 一级a做视频免费观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 男女啪啪激烈高潮av片| av国产久精品久网站免费入址| 高清视频免费观看一区二区| 桃花免费在线播放| 99热全是精品| 日本黄大片高清| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 少妇的逼水好多| 色吧在线观看| 超碰97精品在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 久久 成人 亚洲| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 少妇人妻 视频| 性色av一级| 久久久久国产网址| 日韩av免费高清视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 2022亚洲国产成人精品| 春色校园在线视频观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 2018国产大陆天天弄谢| av线在线观看网站| 国产精品.久久久| 亚洲内射少妇av| 丝瓜视频免费看黄片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 女人久久www免费人成看片| 我要看日韩黄色一级片| 国产色爽女视频免费观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 免费av不卡在线播放| 综合色丁香网| 欧美变态另类bdsm刘玥| 在线观看三级黄色| 女性生殖器流出的白浆| 女人精品久久久久毛片| 欧美 日韩 精品 国产| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲国产精品成人久久小说| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品国产av在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 大码成人一级视频| 国产爽快片一区二区三区| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产精品人妻久久久久久| 久久久精品94久久精品| 国产色婷婷99| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产色爽女视频免费观看| www.色视频.com| 亚洲精品456在线播放app| 久久国产乱子免费精品| 国产日韩欧美视频二区| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久精品夜色国产| 在线观看av片永久免费下载| 色婷婷久久久亚洲欧美| 插逼视频在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 视频中文字幕在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美国产精品一级二级三级 | 午夜久久久在线观看| 日韩视频在线欧美| 七月丁香在线播放| 久久久久久久国产电影| 亚洲熟女精品中文字幕| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人毛片a级毛片在线播放| 插阴视频在线观看视频| 欧美最新免费一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 中文资源天堂在线| 日韩强制内射视频| 日本欧美视频一区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 涩涩av久久男人的天堂| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成年av动漫网址| 久久精品国产自在天天线| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 成人二区视频| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 97精品久久久久久久久久精品| 久久热精品热| 国产精品熟女久久久久浪| 国产熟女欧美一区二区| 插阴视频在线观看视频| 国产av码专区亚洲av| 精品久久久精品久久久| 久久国产精品大桥未久av | av有码第一页| 国产精品久久久久久av不卡| www.av在线官网国产| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久久久久久久成人| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 麻豆成人av视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产在线视频一区二区| 我要看日韩黄色一级片| 高清视频免费观看一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 麻豆成人av视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产在线视频一区二区| 国产av国产精品国产| 免费看光身美女| 一区二区三区四区激情视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲精品亚洲一区二区| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩人妻高清精品专区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 美女内射精品一级片tv| 欧美日韩综合久久久久久| 国产在视频线精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 热re99久久国产66热| 女人久久www免费人成看片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产黄片美女视频| 精品国产国语对白av| 日本免费在线观看一区| 日韩亚洲欧美综合| 中文天堂在线官网| 97精品久久久久久久久久精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 激情五月婷婷亚洲| 午夜视频国产福利| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产日韩欧美在线精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美97在线视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 男女边吃奶边做爰视频| 18+在线观看网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 另类亚洲欧美激情| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美人与善性xxx| 在线观看美女被高潮喷水网站| 九草在线视频观看| 六月丁香七月| 在线天堂最新版资源| 插阴视频在线观看视频| 天堂中文最新版在线下载| 国产成人aa在线观看| freevideosex欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 嫩草影院入口| 国产av码专区亚洲av| 在线 av 中文字幕| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲av综合色区一区| av免费观看日本| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 尾随美女入室| 久久韩国三级中文字幕| 色网站视频免费| 国产在视频线精品| 制服丝袜香蕉在线| 国产美女午夜福利| 深夜a级毛片| 成年av动漫网址| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久婷婷青草| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 欧美3d第一页| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 亚洲图色成人| 午夜激情久久久久久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久午夜综合久久蜜桃| 成年人免费黄色播放视频 | 国产乱人偷精品视频| 亚州av有码| 蜜桃在线观看..| 国产成人免费无遮挡视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 曰老女人黄片| 91aial.com中文字幕在线观看| 高清毛片免费看| 国产成人精品婷婷| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久97久久精品| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产真实伦视频高清在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品色激情综合|