?；悄懰徕c誘導(dǎo)的急性壞死性胰腺炎大鼠基因表達(dá)譜變化

朱國英 朱風(fēng)尚 黃東平 沈曉瑩 宋振云 郜恒駿

·短篇論著·

?；悄懰徕c誘導(dǎo)的急性壞死性胰腺炎大鼠基因表達(dá)譜變化

朱國英 朱風(fēng)尚 黃東平 沈曉瑩 宋振云 郜恒駿

基因芯片技術(shù)是高通量的差異基因表達(dá)研究手段。通過雜交后的生物信息學(xué)分析有助于全面了解復(fù)雜基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在急性壞死性胰腺炎(ANP)中的作用。因此，利用全基因組表達(dá)譜方法分析ANP基因的變化較單個基因的研究具有理論上的優(yōu)勢。李磊等[1]曾報道，腹腔注射雨蛙肽誘導(dǎo)的急性水腫性胰腺炎(AEP)基因表達(dá)譜的變化，但尚未見類似臨床重癥急性胰腺炎(SAP)的ANP模型的胰腺組織基因表達(dá)譜的報道。故本實驗觀察ANP大鼠胰腺組織基因表達(dá)譜的變化。

一、材料與方法

1．動物分組及模型制備：SD大鼠40只，體重180～230 g，雌雄各半，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供(SPF級，合格證號：SCXK滬2003-0002)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和ANP組，各20只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)[2]，采用胰管逆行注入4%?；悄懰徕c(上海國藥集團(tuán))0.1 ml/100 g體重方法制備ANP模型。對照組注入等容積的生理鹽水。術(shù)后48 h記錄存活率，處死大鼠，取血、胰腺組織。

2．血清淀粉酶和C-反應(yīng)蛋白(CRP)檢測：血清淀粉酶和CRP檢測試劑盒購自上海豐翔生物科技有限公司，參照說明書操作。

3．胰腺組織病理檢查：取固定的胰腺組織，常規(guī)切片、HE染色，光鏡下觀察組織病理變化，并采用Schmidt法[3]進(jìn)行評分。

4．胰腺組織基因芯片分析：取液氮凍存胰腺組織，研磨成勻漿，離心取上清。常規(guī)Trizol法提取總RNA。采用Illumina TotalPrep RNA擴(kuò)增試劑盒(上海芯超生物科技有限公司提供)完成RNA一步法逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA和純化，再由cDNA合成aaUTP標(biāo)記的cRNA并純化。用Cy-3標(biāo)記cRNA探針，Illumina雜交試劑盒使cRNA探針片段化。將Illumina大鼠全基因組表達(dá)譜基因芯片置于Ilumina激光共聚焦光微珠芯片(Sentrix BeadChip)平臺上與胰腺cRNA樣本進(jìn)行雜交。

以Illumina BeadChip Reader掃描系統(tǒng)獲取數(shù)字信號，BeadStudio軟件分析熒光信號強(qiáng)度和分析比值。以Cubic Spline法行歸一化處理，篩選差異基因。用在線DAVID生物信息學(xué)分析工具(http:∥david.abcc.ncifcrf.gov)和Gene Ontology(GO)分類標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(http:∥www.geneontology.org)分析差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分[4]；采用KEGG數(shù)據(jù)庫的基因信號通路分析差異基因涉及的生物學(xué)通路[5]。

5．差異基因F11r和Cdh1驗證：采用熒光定量RT-PCR法。F11r(NM_053796)正義鏈5′-TGTCCTGGTAACACTGATTCTCC-3′，反義鏈5′-CAGGAATGACGAGGTCTGTTTG-3′，片段172 bp；Cdh1(NM_031334)正義鏈5′-CCTTGATGCCAGACCGGAAGT-3′，反義鏈5′-GGTCACTGTCCGCTGCCTTC-3′，片段140 bp；內(nèi)參β-actin(NM_031144)正義鏈5′-TTTTGTGCCTTGATAGTTCGC-3′，反義鏈5′-GAGTCCTTCTGACCCATACCC-3′，片段264 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR條件：95℃ 3 min，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)。通過ABI Prism 7500 SDS Software獲得Ct值。ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參，mRNA相對表達(dá)量為2-ΔCt×100%。

6．統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，其中正態(tài)分布計量資料用Student的t檢驗，率用χ2檢驗，非正態(tài)資料采用秩和檢驗。差異基因GO分類采用Fisher精確檢驗和χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

1．動物48 h存活率及血清淀粉酶和CRP水平：對照組死亡2只，ANP組死亡8只，對照組存活率明顯高于ANP組(P=0.028)。ANP組大鼠血清淀粉酶和CRP水平分別為(7892±1776)U/L、(106.5±19.9)mg/L，均顯著高于對照組的(1296±326)U/L、(61.7±15.9)mg/L(P=0.000，P=0.002)。

2．胰腺病理改變：對照組胰腺輕度水腫，呈乳白色，無壞死；ANP組胰腺及周圍脂肪呈黑褐色，壞死明顯。對照組胰腺鏡下見組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡細(xì)胞內(nèi)無空泡、間質(zhì)無明顯水腫、無白細(xì)胞浸潤，病理評分為4.0±1.4；ANP組胰腺腺泡腫脹明顯，大量空泡，不同程度壞死，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤及出血，病理評分為10.3±2.2，較對照組明顯升高(P=0.004)。

3．差異基因表達(dá)譜：比較對照組和ANP組胰腺全基因表達(dá)譜，共篩選到28個差異基因，其中上調(diào)23個，為regenerating islet-derived 3 gamma(Reg3g)；activating transcription factor 3(Atf3)；lamimin, gamma 2(Lamc2)；Rho family GTPase 1 (predicted) (Rnd1)；TG interacting factor (predicted) (Tgif)；potassium channel, subfamily K, member 1 (Kcnk1)；fucosyltransferase 2 (secretor status included) (Fut2)；RAB30, member RAS oncogene family(predicted) (Rsb30)；transformation related protein 53 inducible nuclear protein 1 (Trp53inp1)；coxsackie virus and adenovirus receptor (Cxadr)；keratin complex 2, basic, gene 8 (Krt2-8)；tetraspan 1 (MGC93753)；von Hippel-Lindau syndrome homolog (Vhl)；mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4 (predicted) (Map4k4)；UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3 (predicted) (Galnt3)；tumor differentially expressed 2-like (predicted) (Tde2l)；iGb3 synthase (LOC171553)；adenosine monophosphate deaminase 3 (Ampd3)；B-cell translocation gene 2, anti-proliferative (Btg2)；24-dehydrocholesterol reductase (predicted) (Dhcr24)；fatty acid amide hydrolase (Faah)；junctional adhesion molecule 1 (F11r)；cadherin 1 (Cdh1)。下調(diào)5個，為ATPase, Ca2+transporting, ubiquitous (Atp2a3)；nephrosis 1 homolog, nephrin (human) (Nphs1)；methylcrotonoyl-Coenzyme A carboxylase 1 (alpha) (Mccc1)；hypothetical gene supported by BC087105 (LOC500856)；similar to Integral membrane protein 2A (LOC317218)。

通過GO分類得到32個GO注釋條目，其中涉及生物學(xué)過程共10個GO，主要包括細(xì)胞黏附和黏附生物學(xué)、糖基化、Caspase活性調(diào)節(jié)、肽酶(含內(nèi)肽酶)活性調(diào)節(jié)等過程。涉及的分子功能主要包括鈣離子結(jié)合、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性(含陽離子)、水解酶/連接酶活性、碳水化合物結(jié)合、糖基轉(zhuǎn)移酶活性等10個GO。涉及細(xì)胞組分方面的GO有9個，主要是細(xì)胞間連接、緊密連接、耦合連接、高爾基體功能等。在GO注釋到的差異基因中被注釋到頻數(shù)最高的5個基因是：結(jié)合黏附分子-1受體(F11r)、鈣黏蛋白-1(Cdh1)、遍在鈣離子轉(zhuǎn)運ATP酶(Atp2a3)、層黏蛋白-γ2(Lamc2)、柯薩奇和腺病毒受體(Cxadr)，其中Atp2a3為下調(diào)基因，F(xiàn)11r、Cdh1、Lamc2、Cxadr為上調(diào)基因。

獲得KEGG生物學(xué)通路數(shù)據(jù)注釋有3個，其中有9個差異基因，上調(diào)基因為8個(Cdh1、Vhl、F11r、Dhcr24、Ampd3、Galnt3、Fut2、Lamc2)，下調(diào)的有1個(Mccc1)，代表的生物學(xué)通路主要為細(xì)胞黏附分子通路、代謝通路、腫瘤信號通路，其中代表前兩個通路的基因表達(dá)均上升。

4．差異基因驗證：對感興趣的細(xì)胞黏附分子通路中的兩個基因F11r、Cdh1進(jìn)行實時PCR驗證。ANP組胰腺F11r、Cdh1 mRNA相對表達(dá)量分別是對照組的2.047、3.238倍，與基因芯片的比值2.657、3.151相吻合。

討論Nakada等[6]報道雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎(AP)小鼠胰腺基因表達(dá)譜的變化，F(xiàn)11r和Cdh1mRNA表達(dá)明顯升高。Dusetti等[7]用含7981個基因的小鼠表達(dá)譜芯片研究了正常和AP小鼠間胰腺組織差異基因，共發(fā)現(xiàn)239個基因變化，107個基因上調(diào)，132個基因下調(diào)，其中細(xì)胞黏附類基因在AP發(fā)病中起重要作用。Ji等[8]應(yīng)用?；悄懰狍w外干預(yù)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞，結(jié)果顯示51個基因顯著變化，并認(rèn)為EGR-1是觸發(fā)胰腺炎重要的調(diào)節(jié)因子。本結(jié)果顯示，ANP時胰腺有28個基因表達(dá)發(fā)生明顯變化。經(jīng)過GO和Pathway篩選，均包含的差異基因中，F(xiàn)11r、Cdh1出現(xiàn)的頻次和權(quán)重最高。這兩個基因均參與鈣離子和細(xì)胞黏附分子通路，提示傳統(tǒng)的鈣離子超載理論和細(xì)胞黏附分子改變在ANP發(fā)病中的重要作用在全基因表達(dá)譜上得到了證實。通過實時PCR對F11r、Cdh1mRNA的表達(dá)量進(jìn)行驗證，其結(jié)果和基因芯片一致，說明了基因芯片的可靠性。但F11r、Cdh1在ANP發(fā)病中的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究[9]。

細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的放大在ANP發(fā)病中有重要作用，而本研究差異基因中沒有表現(xiàn)出來，可能原因是時間節(jié)點較晚，而細(xì)胞因子大多已釋放到外周血所致[10]。

[1] 李磊,王興鵬,吳愷.雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎小鼠基因表達(dá)譜研究.中華醫(yī)學(xué)雜志,2005,82:122-123.

[2] 朱國英,李永渝,李學(xué)禮.急性胰腺炎大鼠胰、肝組織IκBα的表達(dá)及中藥新清胰湯的影響.中國病理生理雜志,2006,22:2438-2442.

[3] Deng LH, Xiang DK, Xue P, et al. Effects of Chai-Qin-Cheng-Qi Decoction on cefotaxime in rats with acute necrotizing pancreatitis. World J Gastroenterol, 2009, 15:4439-4443.

[4] Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protoc, 2009, 4:44-57.

[5] 陳蕾,王世鑫,劉萍,等.染矽塵大鼠早期肺組織差異基因表達(dá)譜的研究.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2008,42:515-521.

[6] Nakada S, Tsuneyama K, Kato I, et al. Identification of candidate genes involved in endogenous protection mechanisms against acute pancreatitis in mice. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 391:1342-1347.

[7] Dusetti NJ,Tomasini R,Azizi A,et al.Expression profiling in pancreas during the acute phase of pancreatitis using cDNA microarrays.Biochem Biophys Res Commun,2000,277:660-667.

[8] Ji B, Chen XQ, Misek DE,et al. Pancreatic gene expression during the initiation of acute pancreatitis: identification of EGR-1 as a key regulator. Physiol Genomics, 2003, 14:59-72.

[9] Petersen OH.Ca2+signaling in pancreatic acinar cells: physiology and pathophysiology. Braz J Med Biol Res, 2009, 42:9-16.

[10] Dambrauskas Z, Giese N, Gulbinas A, et al. Different profiles of cytokine expression during mild and severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol, 2010, 16:1845-1853.

2011-01-07)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.021

上海市普陀區(qū)科委科研基金(PTKW08-C03 )

200060 上海，上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院院內(nèi)感染科(朱國英)，普外科(黃東平)；同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院消化疾病研究所(朱風(fēng)尚，郜恒駿)；生物芯片上海國家工程研究中心(沈曉瑩，宋振云，郜恒駿)

朱風(fēng)尚，Email: zhufengshang@126.com