胰島素瘤抑癌基因p27的表達及其與CpG島甲基化表型的關(guān)系

周喬 肖雨 朱麗明 向紅丁 陳元方 陳原稼

·論著·

胰島素瘤抑癌基因p27的表達及其與CpG島甲基化表型的關(guān)系

周喬 肖雨 朱麗明 向紅丁 陳元方 陳原稼

目的探討胰島素瘤抑癌基因p27的表達及其與CpG島甲基化表型(CpG island methylation phenotype, CIMP)間的關(guān)系。方法用免疫組化方法檢測27例胰島素瘤組織及11例瘤旁正常胰腺組織中p27的表達。用甲基化特異性PCR (MSP) 方法檢測這些組織中p16、MLH1、RAR-β、MGMT、THBS1基因的甲基化狀態(tài)。分析p27表達、CIMP與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性。結(jié)果胰島素瘤組織p27蛋白表達陽性率較瘤旁胰腺組織顯著降低(48%比91%，P=0.008)。胰島素瘤組織的高CIMP發(fā)生率為33%(9/27)，瘤旁正常胰腺組織的高CIMP發(fā)生率為18%(2/11)，腫瘤組織為正常胰腺組織的2倍,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.350)。胰島素瘤的MGMT甲基化與p16的甲基化呈顯著負相關(guān)(P=0.004)，胰島素瘤的p27表達與高CIMP呈負相關(guān)的趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.420)；p27的表達和CIMP的發(fā)生與胰島素瘤的臨床病理參數(shù)均無顯著相關(guān)性。結(jié)論胰島素瘤p27表達下調(diào)，并存在高CIMP,提示p27的失活和多基因的表觀遺傳學(xué)異常在該腫瘤的發(fā)生過程中可能起一定作用。

胰腺內(nèi)分泌腫瘤; 胰島素瘤; 抑癌基因p27; CIMP; 甲基化

胰島素瘤是胰腺內(nèi)分泌腫瘤中最常見的一種。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)[1]，部分散發(fā)性胰島素瘤和MEN-1基因失活有關(guān)。近期的研究又發(fā)現(xiàn)胰島素瘤中錯配修復(fù)基因異常,特別是MLH1基因發(fā)生高甲基化[2-3]。文獻報道[4]，在小鼠MEN1突變所導(dǎo)致的胰島素瘤中,p27的表達下降。因此，本實驗觀察人胰島素瘤p27的表達，分析其與CpG島甲基化表型(CpG island methylation phenotype, CIMP)的相關(guān)性，以探尋該腫瘤發(fā)生的分子機制。

材料與方法

一、標本來源及診斷標準

收集1992年至2008年北京協(xié)和醫(yī)院手術(shù)切除經(jīng)病理證實的27例胰島素瘤標本，以11例瘤旁胰腺組織作為對照。 胰島素瘤的診斷標準參照我們已往發(fā)表的文章[3, 5-6]。

二、p27表達的檢測

采用小鼠二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物試劑有限公司)檢測p27蛋白表達。小鼠抗人p27單抗(BD公司)1∶100稀釋。結(jié)果判斷標準按照我們以往研究[2-3]：細胞核有棕黃著色者為陽性細胞。陽性細胞占總細胞數(shù)的百分值>20%為表達陽性。

三、p16、MLH1、RAR-β、MGMT、THBS1的CIMP的測定

按我們以往的方法[3]從冷凍組織和石蠟組織標本中提取基因DNA，并行甲基化修飾。各基因啟動子的PCR引物序列見表1。采用甲基化特異性PCR(MSP)及非甲基化特異性PCR(USP)法檢測基因CpG島的甲基化狀態(tài)。結(jié)果判定：腫瘤組織中有4～5個基因出現(xiàn)甲基化為高CIMP； 0～3個基因出現(xiàn)甲基化為低CIMP。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析,率的比較采用Fisher精確檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般臨床資料

27例胰島素瘤患者中男性8例，女性19例，年齡16～74歲，平均(48±3)歲。術(shù)前血清胰島素水平為(58.1±9.2)mU/L，中位數(shù)49.7mU/L；術(shù)前血糖水平為(2.8±0.2)mmol/L，中位數(shù)2.5 mmol/L。胰島素瘤位于胰頭頸部16例(59%)，胰體尾部11例(41%)。瘤體最大徑≥2 cm者12例(44%),<2 cm 15例(56%)。經(jīng)病理證實，21例(78%)為良性,6例(22%)為惡性。

二、p27蛋白表達

p27蛋白位于腫瘤細胞的胞核(圖1)，腫瘤組織p27陽性表達率為48%(13/27)；瘤旁正常組織中，p27蛋白主要位于胰島內(nèi),導(dǎo)管上皮和腺泡細胞表達較少，陽性表達率為91%(10/11)。胰島素瘤p27蛋白表達率明顯低于瘤旁正常胰腺組織(P=0.008)。

表1 各基因啟動子的PCR引物序列

注： RKO為結(jié)腸癌細胞系，803為胃癌細胞系，PA-1為人神經(jīng)母細胞瘤細胞系

圖1胰島素瘤旁胰腺組織和瘤組織的病理變化(a、c；HE ×200)和p27蛋白表達(b、d；免疫組化染色 ×200)

三、胰島素瘤組織CIMP的狀況

部分組織的CpG島甲基化測定結(jié)果如圖2所示。27例腫瘤組織中,p16的甲基化比例為33%(9/27)，MLH1為81%(22/27)，RAR-β為96%(26/27)，MGMT為81%(22/27)，THBS1為30%(8/27)；高CIMP發(fā)生率為33%(9/27)。11例瘤旁正常胰腺組織中高CIMP發(fā)生率為18%(2/11)。腫瘤組織高CIMP發(fā)生率為對照胰腺組織的2倍,但由于例數(shù)較少,統(tǒng)計學(xué)分析無顯著差異(P=0.350)。在發(fā)生p16甲基化的9例胰島素瘤組織中有4例(44%)同時存在MGMT甲基化,而未發(fā)生p16甲基化的18例腫瘤中均發(fā)生了MGMT甲基化,二者之間存在顯著負相關(guān)(P=0.004)。

M：甲基化條帶，U：無甲基化條帶

圖2胰島素瘤組織p16(a)、MLH1(b)的MSP及USP擴增結(jié)果

四、CIMP與p27表達的相關(guān)分析

14例p27表達丟失或下降的腫瘤中有6例(43%)發(fā)生高CIMP,而13例p27表達正常的腫瘤中僅3例(23%)發(fā)生高CIMP，p27表達與高CIMP呈負相關(guān)的趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.420)。

五、CIMP與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

CIMP的高低與患者性別、年齡、術(shù)前胰島素水平、術(shù)前空腹血糖水平、腫瘤部位、腫瘤大小、良惡性及療效均不相關(guān)(表2)。單獨將每個基因的甲基化與臨床病理資料進行分析,發(fā)現(xiàn)MGMT的甲基化與腫瘤部位具有相關(guān)性(P=0.047),顯示原發(fā)部位在胰頭的胰島素瘤更易發(fā)生MGMT甲基化,而MGMT非甲基化的腫瘤多位于胰體尾。

表2 CIMP與胰島素瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

六、腫瘤組織p27表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

胰島素瘤組織p27表達與患者性別、年齡、術(shù)前胰島素水平、空腹血糖水平、腫瘤部位、腫瘤大小、良惡性及預(yù)后均不相關(guān)(表3)。

表3 腫瘤組織p27表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

討 論

胰島素瘤是最常見的胰腺內(nèi)分泌腫瘤之一,其發(fā)生的分子病理學(xué)機制目前仍不明確,并且臨床上缺乏有效的診斷及鑒別良惡性的分子標記物。 文獻報道在結(jié)直腸癌[7]、乳腺癌[8]、胰腺癌[9]等多種腫瘤中觀察到了CIMP現(xiàn)象。CIMP現(xiàn)象可能在腫瘤的篩查、診斷、高危人群評估、制定最適治療方案中起作用[10]。p27屬于細胞周期調(diào)控蛋白，其表達水平在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺腺癌等多種腫瘤亦有所下降,在結(jié)腸癌中,p27與高CIMP存在顯著相關(guān)性[7]。本實驗檢測胰島素瘤p27蛋白表達, 結(jié)果提示p27在胰島素瘤的表達降低，與文獻結(jié)果一致。

文獻報道[11-13]，甲基化、磷酸化或經(jīng)泛素途徑的降解增加等可能是p27表達下降的原因。我們根據(jù)本實驗室以往的研究結(jié)果及文獻報道挑選了p16、MLH1、RAR-β、MGMT和THBS1等5個基因作為本實驗的一組CIMP標記基因。 通過對27個胰島素瘤標本和11個瘤旁正常胰腺組織這5個基因的甲基化測定,顯示腫瘤組織中高CIMP發(fā)生率高于正常胰腺組織, 但無統(tǒng)計學(xué)差異。 其原因可能是：(1)樣本量較??；(2)瘤旁組織中有3個出現(xiàn)高CIMP現(xiàn)象,提示部分瘤旁正常組織已經(jīng)發(fā)生了分子的改變；(3)對高CIMP的定義不同。文獻以2個或2個以上基因出現(xiàn)甲基化定義為高CIMP[14],而我們以4個及4個以上 (≥4/5) 出現(xiàn)甲基化定義為高CIMP。

文獻報道[15]，腫瘤中MGMT的甲基化往往與其他抑癌基因,如p21、p16和MLH1的甲基化呈正相關(guān)。本研究通過對這5個基因CIMP之間相互關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織p16甲基化與MGMT甲基化間存在顯著負相關(guān)性。而在瘤旁正常組織中,兩者無相關(guān)性。此外，通過對CIMP和p27表達的分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織p27表達下降，高CIMP發(fā)生率增加，而在正常胰腺組織與此正好相反，提示p27的表達下降可能和高CIMP發(fā)生率增高有關(guān),兩者可能在散發(fā)型胰島素瘤的發(fā)生中起作用,闡明其中的分子機制或有助于為散發(fā)型胰島素瘤的診治提供參考。

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2011-05-11)

(本文編輯：呂芳萍)

OccurrenceofCpGislandmethylationphenotypeandexpressionofp27ininsulinoma

ZHOUQiao,XIAOYu,ZHULi-ming,XIANGHong-ding,CHENYuan-fang,CHENYuan-Jia.

DepartmentofGastroenterology,PekingUnionMedicalCollegeHospital;ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100733,China

CHENYuan-jia,Email:yuanjchen@gmail.com

ObjectiveTo study the expression of p27 and its relationship with CpG island methylation phenotype (CIMP) in insulinoma.MethodsExpression of p27 was tested in 27 insulinoma tissues and 11 paired control tissues by immunohistochemistry staining. CpG island methylation of p16，MLH1，RAR-β,MGMT,THBS1(CIMP ) was detected in 27 insulinoma tissues and 11 paired control tissues by methylation specific PCR (MSP). The data of p27 and CIMP expression were correlated with the clinicopathological characteristics.ResultsThe positive expression rate of p27 in insulinoma tissues was significantly lower than that in paired control tissues (48%vs91%,P=0.008). High rate of CIMP occurrence in insulinoma tissues was 33% (9/27), while it was 18%(2/11) in paired control tissues, and difference between the two groups was not statistically significant (P=0.350). The methylation of MGMT was reversely associated with p16 methylation (P=0.004). p27 expression in insulinoma tissues was reversely associated high rate of CIMP occurrence but it was not statistically significant (P=0.420). Neither the expression of p27 nor the occurrence of CIMP was associated with the clinicopathological features.ConclusionsDown-regulation of p27 and high rate of CIMP occurred in insulinomas, suggesting that the inactivation of p27 and epigenetic alterations of several genes might contribute to the carcinogenesis of insulinoma.

Pancreatic endocrine neoplasms; Insulinoma; Tumor suppressor gene p27; CIMP; Methylation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.011

100730 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科(周喬、朱麗明、陳元方、陳原稼)，內(nèi)分泌科衛(wèi)生部重點實驗室(向紅丁)，病理科(肖雨)(周喬現(xiàn)在四川省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，成都 610072)

陳原稼,Email: yuanjchen@gmail.com