基因敲除技術(shù)在結(jié)核病研究中的應(yīng)用

田璽擇 張萬(wàn)江

1989年,美國(guó)科學(xué)家 Capecchi[1]通過研究胚胎干細(xì)胞同源重組原理獲得的基因敲除小鼠取得成功,因此,Capecchi與美國(guó)科學(xué)家Smithies、英國(guó)科學(xué)家 Evans共同分享了2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),成為基因敲除研究史上的又一里程碑。經(jīng)過20多年的不斷發(fā)展,基因敲除技術(shù)(gene knock-out)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域,尤其在結(jié)核病研究中取得了很大進(jìn)展,基因敲除技術(shù)已成為研究結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的重要技術(shù)手段。筆者綜述了基因敲除技術(shù)的原理及其在結(jié)核病研究中的應(yīng)用。

基因敲除的原理、打靶載體的構(gòu)建及其篩選策略

一、基因敲除的原理

基因敲除技術(shù)是建立在同源重組(homologous recombination)和胚胎干細(xì)胞(embryo stem cells,ESC)基礎(chǔ)之上的一種新興生物技術(shù),也是研究基因功能的一種重要方法。首先要在體外構(gòu)建攜帶突變基因的打靶載體,然后將其導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞中,利用基因的同源重組原理,用外源基因序列置換靶基因上的特定序列,通過研究靶基因與外源基因序列整合前后遺傳性狀的改變來研究靶基因的功能[2]。

由于傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)所得到的基因突變存在于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生殖細(xì)胞中,常出現(xiàn)因發(fā)育障礙而早期致死的現(xiàn)象,而條件性基因敲除技術(shù)可以將靶基因的修飾限制于特定的細(xì)胞或個(gè)體某一特定的發(fā)育階段,從而解決了這一難題。自1994年Gu等[3]利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)研制組織特異性基因敲除小鼠獲得成功以來,條件基因敲除技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。條件性基因敲除(conditional gene knock-out)就是在基因敲除的基礎(chǔ)上,利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù),使得對(duì)小鼠基因組修飾的時(shí)間和范圍處于一種可控狀態(tài)。Cre重組酶可特異性識(shí)別loxP核酸序列,將loxP序列之間的目的基因切除,在特定階段、特定細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過與在基因組中引入 LoxP序列的小鼠交配,使子代小鼠的特定細(xì)胞中的靶基因被刪除,從而得到了組織特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠[4-5]。

二、基因打靶載體的構(gòu)建策略

研究者可根據(jù)研究的需要選擇相應(yīng)的載體類型,通常選用的打靶載體有插入型載體和置換型載體。插入型載體的同源序列與靶基因組特定位點(diǎn)發(fā)生同源重組后,整個(gè)載體整合到了靶基因組的特定位點(diǎn)上,而置換型載體的同源序列與靶基因特定位點(diǎn)發(fā)生同源重組后,載體的同源序列取代了靶基因組上的特定序列。

后來又出現(xiàn)了2種新的打靶載體構(gòu)建策略,1991年Hasty等[6]提出了“hit and run”打靶策略,1993年 Askew等[7]提出了“tag and exchange”打靶策略。

三、基因打靶的篩選策略

由于大多數(shù)細(xì)胞難以發(fā)生同源重組介導(dǎo)的基因敲除,因而基因敲除成功的幾率很低。因此,要在基因打靶載體上添加正選擇標(biāo)記基因及負(fù)選擇標(biāo)記基因。正選擇標(biāo)記基因有2個(gè)功能,一是作為選擇標(biāo)記從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離整合了外源基因的細(xì)胞;二是作為突變體置換或插入靶基因的編碼外顯子,使靶基因產(chǎn)生突變。負(fù)選擇標(biāo)記基因的功能主要是對(duì)抗打靶過程中產(chǎn)生的非同源重組,起富集中靶克隆的作用[8]。通常選用的篩選策略有正負(fù)向篩選法(positive and negative selection,PNS)和PCR篩選策略。

正負(fù)向篩選法是指將正選擇基因neo插入到打靶載體同源區(qū)內(nèi)的目的片段中,負(fù)選擇基因HSV-tk則插入到目的片段的外側(cè)。neo基因的插入既可形成基因突變,又是正向標(biāo)記。而負(fù)選擇基因 HSV-tk對(duì)更昔洛韋(Ganciclovir,GANC)敏感,因此含有HSV-tk的重組細(xì)胞可在GANC培養(yǎng)基中被殺死[9]。

PCR篩選法就是在構(gòu)建好的打靶載體上插入一段特定的核酸序列,通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小來鑒別插入突變和同源重組。

基因敲除在結(jié)核病研究中的應(yīng)用

一、基因敲除在結(jié)核分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡作用研究中的應(yīng)用

利用基因敲除技術(shù)來研究結(jié)核分枝桿菌與宿主巨噬細(xì)胞(macrophage)之間的相互作用,對(duì)于揭示結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。被感染的巨噬細(xì)胞在病原體入侵后產(chǎn)生凋亡小體(apoptotic body)的能力是一種古老的先天免疫防御機(jī)制。對(duì)類似結(jié)核分枝桿菌一樣在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存在的病原體來說,抑制巨噬細(xì)胞凋亡對(duì)于其侵入性是非常重要的。

編碼Ⅰ型NADH脫氫酶nuoG亞基的結(jié)核分枝桿菌nuoG基因,對(duì)結(jié)核分枝桿菌介導(dǎo)的抑制宿主巨噬細(xì)胞凋亡有重要意義。Miller等[10]利用基因敲除技術(shù)得到的結(jié)核分枝桿菌nuoG缺失株來研究結(jié)核分枝桿菌nuoG缺失株與巨噬細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系,證實(shí)用半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8及 TNF-α中和抗體來處理含有結(jié)核分枝桿菌nuoG缺失株的人巨噬細(xì)胞后,結(jié)核分枝桿菌nuoG缺失株的凋亡性表型有明顯降低。有趣的是,不僅nuoG敲除引起的凋亡可以使伴有活性氧拮抗劑的巨噬細(xì)胞潛伏期縮短,而且nuoG引起巨噬細(xì)胞分泌TNF-α能力的提高也能達(dá)到同樣的作用。這表明結(jié)核分枝桿菌通過nuoG依賴機(jī)制來抵抗活性氧的損害,以此來阻止TNF-α介導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡,從而逃避巨噬細(xì)胞的殺傷。

巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌感染的天然微環(huán)境,為了抵抗氧化及亞硝基化,并在巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)久存活,結(jié)核分枝桿菌具備一種非常有效的抗氧化復(fù)合體系。在這些抗氧化劑酶當(dāng)中,TpX是結(jié)核分枝桿菌中惟一與硫醇過氧化物酶有同源序列的蛋白,曾有研究者報(bào)道體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌 TpX蛋白的功能與體外過氧化物酶的功能相似,為了研究tpx基因?qū)w內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存活所起的作用,Hu等[11]通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌tpx缺失突變株,結(jié)果顯示該突變株不能在巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)和存活,這說明tpx對(duì)于結(jié)核分枝桿菌抵抗氧化及亞硝基化是必需的。

二、基因敲除在結(jié)核疫苗研究中的應(yīng)用

卡介苗作為預(yù)防結(jié)核病的接種疫苗,具有廣泛使用的安全性和免疫佐劑作用。ERP基因是既存在于有毒結(jié)核分枝桿菌又存在于卡介苗中的一個(gè)毒力基因,敲除卡介苗中的ERP基因有可能提高卡介苗對(duì)免疫缺陷患者使用的安全性。因此,利用基因敲除技術(shù)對(duì)卡介苗進(jìn)行改進(jìn)是開發(fā)新疫苗的一種有益嘗試。

吳芳等[12]利用基因敲除技術(shù)擴(kuò)增ERP基因兩側(cè)序列,連接載體與目的片段,成功構(gòu)建了卡介苗ERP基因的置換型打靶載體,為進(jìn)一步構(gòu)建敲除ERP基因的卡介苗突變株及研究新型結(jié)核疫苗奠定了基礎(chǔ)。

編碼Bruton酪氨酸激酶的btk基因突變可導(dǎo)致伴X染色體(X-linked immune deficiency,XID)的免疫缺陷,該免疫缺陷常伴有B淋巴細(xì)胞為主要表型的功能損害。Kondratieva等[13]在前期研究中證明CBA/N-xid小鼠和野生型CBA小鼠不同,在感染結(jié)核時(shí)不受卡介苗的保護(hù)。在T細(xì)胞反應(yīng)性干擾素γ(IFN-γ-producing T-cells)和活化的巨噬細(xì)胞作為抗結(jié)核的關(guān)鍵因素后,仍然不清楚基因突變是為何主要影響沿T細(xì)胞-巨噬細(xì)胞反應(yīng)軸的B細(xì)胞功能。因此,Tatiana等[13]利用基因敲除和繼承性細(xì)胞遷移的方法來論證說明先前未受重視的B細(xì)胞抑制中性粒細(xì)胞趨化作用的能力。證明B細(xì)胞缺陷會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞異?？焖俚南蛲饨绱碳の镞w移。在這項(xiàng)研究中,利用中性粒細(xì)胞代替巨噬細(xì)胞的方法可大量減少T細(xì)胞反應(yīng)性干擾素γ和損傷的卡介苗,從而使一種更先進(jìn)的卡介苗捕獲能力在XID小鼠中得以實(shí)現(xiàn)。

有研究表明存在于分枝桿菌細(xì)胞壁上的脂甘露糖阿拉伯糖聚糖(LAM)和脂甘露聚糖(LM)對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有重要意義[14]。em bC基因則參與了前體LM合成LAM的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]。李婭莎等[16]根據(jù)基因敲除方法,首先以質(zhì)粒p2N IL為載體構(gòu)建了卡介苗em bC基因打靶載體,篩選鑒定后將陽(yáng)性克隆后電轉(zhuǎn)入卡介苗中,從而構(gòu)建出卡介苗em bC基因敲除株,使其細(xì)胞壁上的LMs/LAMs的比例發(fā)生改變,為卡介苗免疫活性的研究奠定了可靠基礎(chǔ)。

三、基因敲除在結(jié)核分枝桿菌毒力基因研究中的應(yīng)用

毒力基因的研究對(duì)于闡明結(jié)核的發(fā)病機(jī)理,開發(fā)抗結(jié)核新藥及結(jié)核疫苗有非常重要的意義。SecA1和SecA2是目前研究較多的毒力基因,在結(jié)核分枝桿菌中,SecA1是最基本的總務(wù)蛋白,而SecA2則是輔助分泌因子。Miriam等[17]通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌SecA2缺失突變株,該突變株在大鼠體內(nèi)的毒力有明顯減弱。通過比較野生型結(jié)核分枝桿菌和SecA2缺失突變株,發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶A(SodA)是依賴SecA2分泌的蛋白,而SodA缺乏經(jīng)典的蛋白排出信號(hào)序列,提示SodA排出方式是一種新的分泌旁路,Miriam等[17]的研究表明這種分泌旁路是結(jié)核分枝桿菌逃避巨噬細(xì)胞殺傷的毒力機(jī)制之一。

已有研究表明,RD1是卡介苗和毒力菌株之間惟一有差別的區(qū)域,卡介苗不含RD1,而RD1存在于所有結(jié)核分枝桿菌有毒菌株中。Lewis等[18]敲除了H37Rv強(qiáng)毒株中的RD1基因,并研究其感染人單核細(xì)胞(T HP-1)、由人外周血單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞及C57BL/6小鼠后的毒力變化,發(fā)現(xiàn)在以上3種系統(tǒng)中,H37Rv RD1基因缺失突變株的毒力比結(jié)核分枝桿菌的毒力有顯著下降,并與卡介苗類似。因此,研究RD1基因?qū)τ诹私饨Y(jié)核分枝桿菌的毒力及卡介苗的減毒作用都具有非常重要的意義。

結(jié) 語(yǔ)

基因敲除技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡作用及結(jié)核疫苗的研究等方面應(yīng)用較為廣泛,但在毒力基因、耐藥性及臨床診斷方面的應(yīng)用較少。研究結(jié)核分枝桿菌毒力基因?qū)τ趶氐琢私夂涂刂平Y(jié)核分枝桿菌具有非常重要的意義。目前,雖然成功證實(shí)了一些結(jié)核分枝桿菌的毒力基因,但對(duì)毒力基因的調(diào)控機(jī)制及其功能卻知之甚少,而基因敲除技術(shù)在基因功能的研究方面有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。由于基因敲除可以實(shí)現(xiàn)靶基因功能的完全喪失,而基因沉默是使基因不表達(dá)或低表達(dá),因此其對(duì)毒力基因及耐藥基因功能的研究具有RNAi等基因沉默技術(shù)無(wú)法替代的作用。相信隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,基因敲除技術(shù)在結(jié)核病各方面的研究中將會(huì)迎來更美好的應(yīng)用前景。

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