應(yīng)用基因芯片方法檢測結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼的耐藥性

張俊仙 吳雪瓊 陽幼榮 梁艷

眾所周知,耐多藥結(jié)核病已經(jīng)嚴(yán)重影響了全球結(jié)核病的控制和治療。耐多藥結(jié)核病是指結(jié)核患者至少對(duì)利福平和異煙肼2種最主要的一線抗結(jié)核藥物耐受。然而,由于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriu m tuberculosis,Mtb)是慢生長分枝桿菌,常規(guī)的藥敏試驗(yàn)需4～8周的時(shí)間,因此結(jié)核患者通常不能得到及時(shí)、有效的治療,導(dǎo)致耐多藥結(jié)核患者結(jié)核菌的增殖和傳播。因此,需要建立一種操作簡便、快速的藥物敏感性試驗(yàn)方法,這對(duì)于控制耐多藥結(jié)核病的傳播具有重要的意義。

近年來出現(xiàn)很多耐藥性檢測的新方法,如PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-Single Strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-restrition fragment length polymophism,PCR-RFLP)、DNA 測序法、分子燈塔法、噬菌體生物擴(kuò)增法等,都因?yàn)楦鞣N各樣的問題難以在臨床上廣泛推廣。筆者應(yīng)用PCR-基因芯片和基因測序方法對(duì)30株利福平和異煙肼敏感株和50株利福平和異煙肼耐藥株進(jìn)行檢測,以期為耐多藥結(jié)核病的檢測提供簡單、快速、有效的方法。

材料與方法

一、菌株來源

80株Mtb臨床分離株由本室保存,已按全國結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程進(jìn)行菌種鑒定證實(shí)為Mtb,并根據(jù)傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇30株利福平和異煙肼敏感株、50株耐利福平和異煙肼分離株。Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv來自中國藥品生物制品檢定所。

二、試劑和儀器

Mtb耐藥檢測試劑盒(芯片法)購自北京百奧瑞生物技術(shù)有限公司。PCR擴(kuò)增儀和 LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀等均為博奧生物有限公司提供。

三、細(xì)菌DNA的制備

采用本室自制的標(biāo)本前處理試劑盒提取DNA,置-20℃保存?zhèn)溆肹1]。

四、PCR擴(kuò)增

按試劑盒說明書進(jìn)行。每管PCR反應(yīng)體系總體積為20 μ l,其中 Mtb分離株 DNA 模板為2 μ l,PCR擴(kuò)增試劑1、PCR擴(kuò)增試劑2和PCR擴(kuò)增試劑3各 18 μ l。PCR產(chǎn)物1為對(duì)照產(chǎn)物,與兩種微陣列都進(jìn)行雜交。PCR產(chǎn)物2為rpoB基因的擴(kuò)增產(chǎn)物,與利福平微陣列相對(duì)應(yīng);PCR產(chǎn)物3為katG基因及inhA基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增產(chǎn)物,與異煙肼微陣列相對(duì)應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?7℃600 s,94℃600 s;94℃30 s,60℃30 s,72℃40 s,35個(gè)循環(huán);然后94℃30 s,72℃60 s,10個(gè)循環(huán);最后置 72℃420 s。

五、基因芯片

檢測探針和對(duì)照探針各重復(fù)5個(gè)點(diǎn),每行1～5和6～10分別為同一個(gè)探針,利福平相關(guān)rpoB基因的探針排布示意見表1。異煙肼相關(guān)katG基因和inhA基因啟動(dòng)子的探針排布示意見表2。

六、芯片雜交和結(jié)果判讀

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。簡而言之,每管含雜交緩沖液9 μ l,分別加入同一樣品的PCR產(chǎn)物1和 PCR產(chǎn)物2各 3 μ l,或者加入 PCR產(chǎn)物 1和PCR產(chǎn)物3各3 μ l。置于PCR擴(kuò)增儀中于95℃變性5 min,然后冰浴 3 min;將13.5μ l雜交反應(yīng)混合物經(jīng)蓋片的加樣孔加入,迅速蓋上雜交盒并密封;放入50℃預(yù)熱的恒溫水浴鍋中120 min;水平取出雜交盒,拆開取出芯片,洗滌后離心甩干。置LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀中讀取信號(hào)、判讀結(jié)果。

表1 利福平相關(guān)rpoB基因的探針排布

表2 異煙肼相關(guān)katG基因和inhA基因啟動(dòng)子的探針排布

七、PCR-直接測序法

根據(jù)Mtb序列,用軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)利福平上下游測序引物rpoB3、rpoB4,可擴(kuò)增rpoB基因產(chǎn)生240 bp片段,其中包括507～533位密碼子之間81 bp熱點(diǎn)區(qū)間的序列。設(shè)計(jì)異煙肼上下游測序引物 katG 1、katG2和 inhA1、inhA2,可分別擴(kuò)增katG基因和inhA基因產(chǎn)生273 bp和255 bp片段,分別包括常見的katG基因315位密碼子和inhA基因啟動(dòng)子-15位突變。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳,均為陽性,說明沒有基因缺失。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司進(jìn)行基因測序。

結(jié) 果

一、芯片雜交結(jié)果

PCR-芯片雜交結(jié)果見表3。30株Mtb利福平敏感株rpoB基因、異煙肼敏感株katG基因和inhA基因芯片雜交結(jié)果與Mtb標(biāo)準(zhǔn)株結(jié)果一致,均為Mtb野生型。

50株Mtb耐利福平分離株中,7株芯片雜交為野生型;42株有單位點(diǎn)突變,1株有雙位點(diǎn)突變。以80株Mtb臨床分離株藥敏檢測結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn),芯片檢測的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確率分別是 86.00%(43/50)、100.00%(30/30)、100.00%(43/43)、81.08%(30/37)、91.25%(73/80)。43株耐藥突變株中,28株(65.12%)為 rpoB基因 531位突變,其中 26株TCG→T TG突變,2株 TCG→TGG突變;6株(13.95%)為526位突變,其中4株CAC→TAC突變,1株CAC→CGC突變,1株CAC→GAC突變;4株(9.30%)516位突變,2株GAC→GTC突變,2株GAC→TAC突變;3株(6.97%)511位突變,均為CTG→CCG突變;1株(2.33%)513位CAA→AAA突變;1株(2.33%)雙位點(diǎn)突變?yōu)?511位CTG→CCG和516位GAC→GGC突變。部分芯片雜交結(jié)果見圖1。

表3 50株利福平和異煙肼耐藥株P(guān)CR-基因芯片檢測與基因測序結(jié)果

圖1 Mtb利福平rpoB基因部分芯片雜交圖

50株Mtb異煙肼耐藥株中,14株芯片雜交均為野生型,36株有katG和/或inhA突變,芯片檢測的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確率分別.72.00%(36/50)、100.00%(30/30)、100.00%(36/36)、68.18%(30/44)、82.50%(66/80)。31株芯片檢測有katG突變的分離株中,30株315位AGC→ACC突變和1株315位AGC→AAC突變;7株芯片檢測有inhA突變的分離株均為-15位C→T突變;其中2株既有katG突變又有inhA突變。部分芯片雜交結(jié)果見圖2。

二、PCR-直接測序結(jié)果

結(jié)果見表3。30株Mtb利福平和異煙肼敏感株DNA測序結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果一致,均為Mtb野生型。

圖2.tb異煙肼katG基因和inhA啟動(dòng)子芯片雜交圖

50株Mtb耐利福平分離株中,44株基因測序結(jié)果與PCR-基因芯片檢測結(jié)果一致,其中3株均為rpoB野生型,41株均為突變型。6株基因測序結(jié)果與PCR-基因芯片檢測結(jié)果不一致,其中4株為單位點(diǎn)突變,芯片上無相應(yīng)的探針(分別是531位TCG→TAG、515位 ATG→ATA、513位 CAA→CAT和522位TCG→CAG);2株測序結(jié)果為雙位點(diǎn)突變,其中各有1個(gè)突變位點(diǎn)芯片上無相應(yīng)的探針,分別是516位GAC→AAC、526位CAC→CAG 突變。

50株Mtb耐異煙肼分離株中,47株katG基因測序結(jié)果與 PCR-基因芯片檢測結(jié)果一致,其中16株均為野生型,31株均為315位密碼子突變;3株katG基因測序結(jié)果與 PCR-基因芯片不一致,芯片上無相應(yīng)的探針,分別為299位GGC→GTC突變、322位ACG→GCG突變和 291位 GCT→GAT突變。37株inhA基因測序結(jié)果與PCR-基因芯片檢測結(jié)果一致,其中30株均為野生型,7株均為-15位突變型;13株inhA基因測序結(jié)果與PCR-基因芯片檢測結(jié)果不一致,芯片上無相應(yīng)的探針,其中10株為68位G→A突變,3株分別為-8位T→C、-21位G→C和-17位G→T突變。

討 論

目前的研究表明,大約95%以上的Mtb耐利福平分離株在RNA聚合酶β亞單位編碼基因rpoB的507-533位密碼子的81bp熱點(diǎn)區(qū)域有突變[2],90%的點(diǎn)突變發(fā)生在該區(qū)域11個(gè)氨基酸密碼子之一的部位,其中最常見的突變位點(diǎn)是531位、526位和516位,并且531＞526＞516[3-5]。而Mtb耐異煙肼主要與katG基因和inhA啟動(dòng)子突變有關(guān),katG基因最常見的突變是315位密碼子AGC→ACC的突變,該突變引起過氧化氫酶活性降低,導(dǎo)致異煙肼耐藥[6]。InhA基因編碼脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NADH依賴的enoyl-ACP還原酶),是分枝菌酸細(xì)胞壁合成的必需成分,活化的異煙肼結(jié)合到NADH上抑制了依賴NADH酶的活性,抑制了分枝菌酸的合成而導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。inhA基因的突變修改了該酶,使它失去了和NADH的親和力,導(dǎo)致異煙肼耐藥[7-8]。因此,這些區(qū)域是利福平和異煙肼耐藥株分子檢測的主要靶位[9-11]。

基因芯片技術(shù)是目前分子診斷的先進(jìn)方法。國內(nèi)外很多專家分別報(bào)道用基因芯片檢測耐利福平Mtb標(biāo)本,其檢測結(jié)果與測序結(jié)果大多數(shù)相符[12-13]。因此,應(yīng)用基因芯片快速檢出rpoB基因、katG基因和inhA基因突變可以作為耐多藥結(jié)核病的診斷指標(biāo)。

本研究應(yīng)用已商品化的基因芯片分析Mtb rpoB基因的6個(gè)野生型和13個(gè)突變型位點(diǎn),分析katG基因315位密碼子的1個(gè)野生型和2個(gè)突變型及inhA基因啟動(dòng)子區(qū)-15位的野生型和突變型,因此,可檢出耐多藥結(jié)核病常見的基因突變位點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)中30株Mtb利福平和異煙肼敏感株中,DNA芯片雜交結(jié)果也均為野生型,特異度為100.00%。50株耐利福平臨床分離株中43株可檢測到rpoB基因突變,靈敏度為86.00%,與郭乃洲等[14]報(bào)道的一致。這是因?yàn)樵摶蜿嚵刑结樦话ㄗ畛Ｒ姷?3種突變,基因測序結(jié)果證明4株突變株芯片上無相應(yīng)的突變探針,因此,基因芯片檢測的靈敏度低于基因測序。此外,3株在分析的部位未發(fā)現(xiàn)基因突變,有可能在本檢測范圍外的其他位點(diǎn)存在突變,或者是存在其他耐藥機(jī)制,或者傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)誤差所致。本試驗(yàn)中,檢測到的最常見的突變位點(diǎn)也是531位、526位和516位密碼子,與報(bào)道一致。

50株Mtb耐異煙肼分離株中,36株有katG和(或)inhA突變,靈敏度為 72.00%,其中katG 基因突變率為62%,與袁瑛等[15]、菅記涌等[16]報(bào)道的一致;inhA-15位基因突變率僅為 14%,與Morris等[17]報(bào)道的一致。由于芯片只能檢測到常見的野生型和突變型,因此,katG基因測序顯示的3株少見的突變基因型芯片未能檢出。此外,16株在分析的部位未發(fā)現(xiàn)基因突變,筆者將進(jìn)一步分析,查找原因。

在耐異煙肼分離株中,通過PCR-基因芯片只檢出7株inhA-15位C→T突變,但基因測序發(fā)現(xiàn)10株芯片檢測敏感的菌株存在inhA 68位G→A突變,該突變?yōu)槭状螆?bào)道,它在異煙肼敏感菌株中不存在,但在測序證實(shí)的20株inhA基因突變株中,該突變基因型占了50%,高于inhA-15位突變,該突變是否與異煙肼耐受相關(guān)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之,用PCR-基因芯片可快速、特異地檢測出大多數(shù)Mtb耐多藥分離株,用于臨床耐藥性檢測,可指導(dǎo)臨床治療。

[1] 張敦熔.現(xiàn)代結(jié)核病學(xué).北京：人民軍醫(yī)出版社,2000：96-98.

[2] Musser JM.Antimicrobial agent resistance in mycobacteria：molecular genetic insights(Review). Clin Microbiol Rev,1995,8(4)：496-514.

[3] Nachamkin I,Kang C,Weinstein MP.Detection of resistance to isoniazid,rifampin,and streptomycin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by molecular methods.Clin Infect Dis,1997,24(5)：894-900.

[4] Jou R,Chen HY,Chiang CY,et al.Genetic diversity of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates and identification of 11 novel rpoB alleles in Taiwan.J Clin Microbiol,2005,43(3)：1390-1394.

[5] Bolotin S,Alexander DC,Chedore P,et al.M olecular characterization of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Ontario,Canada.J Antimicrob Chemother,2009,64(2)：263-266.

[6].usser JM,Kapur V,Williams DL,et al.Characterization of the catalase-peroxidase gene(katG)and inhA locus in isoniazid-resistant and-susceptible strains of Mycobacterium tuberculosis by automated DNA sequencing：restricted array of mutations associated with drug resistance.J Infect Dis,1996,173(1)：196-202.

[7] Luckner SR,Liu N,am Ende CW,et al.A slow,tight binding inhibitor of InhA,the enoyl-acyl carrier protein reductase from Mycobacterium tuberculosis.J Biol Chem,2010,285(19)：14330-14337.

[8] Dessen A,Quémard A,Blanchard JS,et al.Crystal structure and function of the isoniazid target of Mycobacterium tuberculosis.Science,1995,267(5204)：1638-1641.

[9] Drobniewski FA,Watterson SA,Wilson SM,et al.A clinical,microbiological and economic analysis of a national service for the rapid molecular diagnosis of tuberculosis and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis.J Med Microbiol,2000,49(3)：271-278.

[10] Chaoui I,Sabouni R,Kourout M,et al.Analysis of isoniazid,streptomycin and ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from Morocco.J Infect Dev Ctries,2009,3(4)：278-284.

[11] Banerjee A,Dubnau E,Quemard A,et al.Inh A,a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis.Science,1994,263(5144)：227-230.

[12] 梁莉,樂軍,李瑤,等.利用基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分支桿菌耐利福平分離株rpoB基因突變的研究.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2005,15(8)：841-844.

[13] Aragón LM,Navarro F,Heiser V,et al.Rapid detection of specific gene mutations associated with isoniazid or rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates using non-fluorescent low-density DNA microarrays.J Antimicrob Chemother,2006,57(5)：825-831.

[14] 郭乃洲,王萬相,嚴(yán)愛華,等.顯色法芯片檢測結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥基因.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006,26(6)：567-570.

[15] 袁瑛,顧德林,顧紅艷.耐多藥結(jié)核分枝桿菌 KatG及rpoB基因變異的研究.臨床薈萃,2006,21(12)：863-864.

[16] 菅記涌,王嫩寒,易俊莉,等.M TBDR plus方法快速檢測北京地區(qū)臨床結(jié)核分枝桿菌分離株利福平和異煙肼耐藥性效果評(píng)價(jià).中國防癆雜志,2010,32(10)：611-614.

[17] Morris S,Bai GH,Suffys P,et al.M olecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.J Infect Dis,1995,171(4)：954-960.