與大腸癌分化相關(guān)的基因標(biāo)記物

甘 毅， 陳道瑾， 鄒 瓊， 李小榮

大腸癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1］，其分化程度對腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后都有著重要影響。分化是腫瘤的一種生物學(xué)特征，分化程度是指腫瘤細胞接近正常細胞的程度，分化得越好(高分化)，意味著腫瘤細胞越接近相應(yīng)的正常發(fā)源組織，而分化越低(低分化或未分化)，細胞和相應(yīng)正常發(fā)源組織區(qū)別越大。分化差的腫瘤，惡性度高，生長迅速，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前發(fā)現(xiàn)在大腸癌組織中，存在一些與分化相關(guān)的腫瘤基因及標(biāo)記物，檢測其表達與否及表達水平的高低將有助于評估病情和預(yù)后。本文依據(jù)功能不同從癌基因、抑癌基因兩方面進行綜述。

1 癌基因及標(biāo)記物

腫瘤的發(fā)生是原癌基因激活和抑癌基因失活共同作用的結(jié)果［2］。癌基因能使正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，其編碼的蛋白一般與細胞增殖有關(guān)，是細胞生長發(fā)育中不可缺少的功能性基因。大多數(shù)情況下，癌基因處于不表達或低表達狀態(tài)，不會引起細胞惡變，故也稱“原癌基因”。當(dāng)原癌基因在理化等因素的作用下發(fā)生突變、易位、擴增等改變時，可被激活成癌基因，導(dǎo)致正常細胞失控，出現(xiàn)惡變或異常增生。與大腸癌分化相關(guān)的癌基因有ras、myc等。

1.1 ras基因 ras基因是一種原癌基因，首先發(fā)現(xiàn)于大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma)，調(diào)控細胞的生長和分化，其的激活是人體腫瘤發(fā)生過程中最常見的基因異常。ras基因可分為 K-ras、H-ras和 N-ras基因［3］，共同編碼的一種蛋白——P21參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在大腸癌組織中，K-ras基因突變占主導(dǎo)地位，是最常發(fā)生突變的原癌基因［4］，也被認為是黏膜上皮癌變的一個早期步驟［5］。Fransen等［6］認為，ras基因突變導(dǎo)致ras-mRNA轉(zhuǎn)錄加速，ras蛋白合成增加，細胞自發(fā)或過度傳遞生長信號，造成生長紊亂及腫瘤產(chǎn)生。陳大偉等［7］用免疫組化法檢測92例大腸癌組織中ras蛋白，認為ras蛋白表達與大腸癌生物學(xué)行為及大腸癌預(yù)后相關(guān)。ras蛋白在高、中、低分化大腸癌的表達率分別是 44.44%、56.13%、85.71%，顯示隨著癌細胞分化程度的降低，ras蛋白表達率逐漸升高，且高、低分化之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。綜上，檢測ras基因突變情況對大腸腫瘤的治療和預(yù)后監(jiān)測具有一定的指導(dǎo)意義。

1.2 myc基因 myc基因(myelocytomatosis oncogene)，即髓細胞增生原癌基因，屬核轉(zhuǎn)錄因子類原癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)在核內(nèi)對DNA轉(zhuǎn)錄實施調(diào)控，影響細胞增殖及腫瘤發(fā)生［8］。myc基因包括C-myc、N-myc、L-myc，C-myc 基因一般與細胞的生長狀態(tài)有關(guān)，其擴增和過度表達與腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，在細胞增生過程中，C-myc可促使細胞從G0期進入G1期，進而細胞由靜止期激活至S期并進行DNA合成，調(diào)節(jié)細胞生長、分化或向惡性轉(zhuǎn)化。當(dāng)細胞分化完成，C-myc表達降低。在人類的腫瘤中，常有 C-myc基因的過度表達、擴增或重排。Mosnier等［9］報道約2/3大腸癌組織myc的 mRNA表達較正常黏膜高3～24倍。另外，C-myc基因表達增強常提示大腸癌組織分化較低，預(yù)后不良。Heerdt等［10］檢測結(jié)腸癌的C-myc表達，結(jié)果顯示在黏液型和低分化型中C-myc高表達率占53.8%和42.3%，而中分化及高分化型的C-myc高表達率僅為6.9%，認為在大腸瘤進展過程中存在C-myc基因堆積。宮桂華等［11］應(yīng)用DNA斑點雜交技術(shù)對44例大腸癌及相鄰正常黏膜組織進行C-myc基因擴增分析，發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中C-myc基因擴增率為61.4%，并與分化程度密切相關(guān)，其中黏液腺癌與低分化腺癌的擴增率分別為84.6%和71.4%，明顯高于高分化腺癌(45.8%，P ＜0.05)，提示 C-myc基因擴增可使腫瘤惡性程度增加。余志龍等［12］采用免疫組化Elivison法，發(fā)現(xiàn)C-myc在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸黏膜組織中的表達差異顯著，其表達在癌細胞分化程度、轉(zhuǎn)移及分期上也有顯著差異(P＜0.05)，認為C-myc蛋白高表達對判斷直腸癌預(yù)后及轉(zhuǎn)移有重要參考價值。

2 抑癌基因及標(biāo)記物

抑癌基因是正常細胞中存在的一類可抑制細胞生長和增殖分裂的基因，激活時可抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡。其能對癌基因表達進行負調(diào)節(jié)，阻抑細胞的癌變。當(dāng)抑癌基因發(fā)生抑制或丟失后，可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

2.1 大腸癌缺失基因 大腸癌缺失基因(deleted in coloretal cancer，DCC)是目前序列最長的抑癌基因，其表達產(chǎn)物為跨膜磷蛋白——DCC蛋白。DCC基因、DCC mRNA和DCC蛋白在正常大腸黏膜均為陽性表達，而在大腸腫瘤中，其表達常減少或缺失，特別在腫瘤晚期［13］。Fearon 等［14］發(fā)現(xiàn)，大腸癌中隨著惡性程度提高，DCC基因缺失率隨之上升。郭偉等［15］采用RT-PCR和免疫組化法，發(fā)現(xiàn)大腸正常黏膜DCC mRNA缺失率為0%，腺瘤DCC mRNA缺失率為11.1%，腺癌的缺失率為 60.6%(P ＜0.01)。此外，DCCmRNA缺失率還與大腸腫瘤分化程度相關(guān)，高分化腺癌DCC mRNA的缺失率為60.6%，低分化腺癌中缺失率則升高為85.0%，顯示 DCC mRNA表達缺失與癌細胞分化之間存在顯著相關(guān)性(P ＜0.01)。Saito等［16］應(yīng)用 western blot和免疫組化法研究23例結(jié)腸癌標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)腫瘤中DCC基因缺失率為(66.7%)，其編碼產(chǎn)物DCC蛋白在癌組織中的表達水平比在癌旁正常黏膜和腺瘤中都顯著下降，并與腫瘤分化類型和遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P＜0.01)，DCC蛋白缺失的患者有更高的復(fù)發(fā)率和更低的5年生存率(P＜0.01)，提示DCC蛋白在腫瘤的進展和預(yù)后中起重要作用。此外，徐美東等［17］采用免疫組化Envision TM法檢測大腸癌中DCC蛋白表達，顯示正常黏膜中陽性率為100%，癌組織中陽性率僅56.1%，且其表達與腫瘤的分化、術(shù)后轉(zhuǎn)移、5年生存率有相關(guān)性(P＜0.05)，分化越低，缺失率越高，認為DCC表達水平可作為大腸癌獨立的預(yù)后因素，DCC基因的表達缺失可以作為判斷大腸癌轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的獨立指標(biāo)。

2.2 p16基因 p16基因是1994年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，又稱多腫瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1，MTS1)，直接參與調(diào)控細胞周期，負調(diào)節(jié)細胞增殖及分裂。正常細胞在分裂增殖周期中，G1期→S期和G2期→M期是2個主要的時期轉(zhuǎn)換點。p16基因編碼的P16蛋白可結(jié)合細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)并使其失活，阻礙細胞從G1期進入S期，從而阻止細胞增生和增殖［18］。一旦p16基因發(fā)生缺失、突變，即可導(dǎo)致P16蛋白合成障礙，細胞增殖將失控并可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生［19］。p16基因和P16蛋白無論在體內(nèi)還是體外均有抑制和調(diào)控大腸癌細胞增殖的作用［18］。王石等［20］采用免疫組化SP法檢測正常黏膜與大腸癌組織中P16蛋白的表達，顯示癌組織P16蛋白陽性率顯著低于正常腸黏膜(P＜0.05)，且P16蛋白表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Duke's分期等密切相關(guān)(P＜0.05)，認為P16蛋白在大腸癌組織中表達下調(diào)，且P16蛋白表達與大腸癌的臨床病理特征密切相關(guān)。黃玉新等［21］采用免疫組化ABC法，檢測在正常大腸組織和大腸癌組織中P16蛋白的陽性率分別為75.0%和35.7%(P＜0.01)，P16蛋白表達隨著腫瘤組織分化程度的降低而減弱，陽性表達率有顯著性差異(P＜0.05)，認為P16蛋白表達缺失與腫瘤分化不良有關(guān)(r=0.3383，P ＜0.05)，有助于判斷腫瘤分化程度及估計預(yù)后。其他研究實驗也取得了相似結(jié)果［22］。張紅等［23］采用免疫組化法，發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中P16蛋白陽性表達率與分化程度相關(guān)，低分化癌的P16蛋白陽性率明顯低于高分化癌(P＜0.05)，在5例黏液癌及2例未分化癌中無1例表達(P＜0.01)，提示P16蛋白表達缺失與大腸癌的分化程度密切相關(guān)。馬晉平等［24］應(yīng)用半定量多重PCR法檢測p16基因的純合缺失情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌p16基因純合缺失時均為低分化腺癌，顯示p16基因異常與胃腸道惡性腫瘤的生物學(xué)行為有一定的意義。

2.3 nm23基因 nm23基因不是抑癌基因，但卻具有抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移表型的功能，屬于腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因(tumor metastasis suppressor gene，non-metastasis)，最早于1988年由美國Steeg發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白酶能夠直接或間接地抑制具有促進轉(zhuǎn)移作用的蛋白，從而降低癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。nm23基因蛋白通過影響微管聚合及磷脂酰肌醇信號傳遞途徑來調(diào)節(jié)細胞代謝，對腫瘤的增殖、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移起重要的作用［25］。目前已發(fā)現(xiàn)5種nm23基因，分別為 nm23-H1、nm23-H2、nm23-H3、nm23-H4和nm23-H5，研究最多的是nm23-H1。在體外實驗中，如將結(jié)腸腫瘤細胞株nm23-H1基因表達進行“沉默”，可促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、游走和侵襲［25］。鄭鵬才等［26］報道 nm23-H1 在大腸癌中的表達與分化有關(guān)，在高分化大腸癌中，nm23-H1基因陽性率可達85%，在未分化大腸癌中陽性表達率僅20%(P ＜0.001)。曹永等［27］采用免疫組化 SP 法檢測結(jié)腸癌和正常黏膜組織，發(fā)現(xiàn)nm23在大腸癌中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、Duke's分期有明顯相關(guān)性(P＜0.01)，認為nm23的表達與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為判斷結(jié)腸癌預(yù)后的指標(biāo)。邵國安等［28］研究在結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤和癌旁正常結(jié)腸黏膜組織中nm23-H1的表達，顯示nm23-H1的表達在結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤和正常結(jié)腸黏膜組織中差異有顯著性(P＜0.01)，分化程度低的結(jié)腸癌組織中nm23-H1表達率低于分化程度高的結(jié)腸癌組織。

3 結(jié)論

腫瘤的分化是涉及到一系列多步驟的復(fù)雜過程，各種腫瘤基因及其表達產(chǎn)物可能在其中發(fā)揮了重要的功能。研究和檢測他們在腫瘤組織內(nèi)的表達，有助于給疾病診斷和評估預(yù)后提供新的思路，可能作為對傳統(tǒng)病理檢查方法的一種有益補充。當(dāng)前面臨的主要問題是各種檢測方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化和自動化，各項檢測的價格昂貴，因此，大規(guī)模的臨床應(yīng)用還有待時日。我們期待將來會有經(jīng)濟、客觀、準(zhǔn)確和自動化的檢測方法或儀器出現(xiàn)，在一定程度上能替代傳統(tǒng)的病理切片方法來完成對標(biāo)本的病理診斷和分化判定，這也是我們臨床工作者共同努力的方向。

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