胰腺癌干細(xì)胞研究進(jìn)展

杜志勇 韓寶三 彭承宏

·綜述與講座·

胰腺癌干細(xì)胞研究進(jìn)展

杜志勇 韓寶三 彭承宏

胰腺癌是一種惡性程度極高，預(yù)后極差的腫瘤，手術(shù)切除率低且術(shù)后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并且對(duì)放、化療不敏感。目前，人們?cè)谀[瘤的研究中提出了腫瘤干細(xì)胞理論。該理論認(rèn)為，腫瘤內(nèi)部存在一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)，它具備無限增殖、多向分化、自我更新和極強(qiáng)的成瘤能力，形成腫瘤并維持腫瘤的生長，且對(duì)常規(guī)的放化療更不敏感，還可能是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源。該理論首先在血液系統(tǒng)腫瘤的研究中獲得突破[1]。在實(shí)體瘤中，目前已經(jīng)在包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中分離出了相應(yīng)的CSCs[2-3]。本文就胰腺癌干細(xì)胞(PCSCs)的相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

一、PCSCs的表型

2007年，兩個(gè)不同的研究小組分別報(bào)道了不同表型的PCSCs。Li等[4]將新鮮人胰腺癌標(biāo)本種植于非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下進(jìn)行胰腺癌實(shí)質(zhì)細(xì)胞的純化和擴(kuò)增，再采用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)發(fā)現(xiàn)胰腺癌中存在0.2%～0.8%的CD44+CD24+ESA+細(xì)胞，該亞群細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出高成瘤性，連續(xù)傳代成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其致瘤能力及在胰腺癌細(xì)胞中的比例保持不變，組織學(xué)發(fā)現(xiàn)其形成的腫瘤和原發(fā)腫瘤類似，兩者的胰腺癌分化標(biāo)志物SLOOP和stratifin也有相同的表達(dá)模式。這說明該亞群細(xì)胞具有極強(qiáng)的自我更新和分化能力，而且其高表達(dá)與干細(xì)胞自我更新密切相關(guān)的Shh和多梳基因家族Bmi-1，因此該亞群細(xì)胞被認(rèn)為是PCSCs。Hermann等[5]從人胰腺癌組織和人胰腺癌細(xì)胞系L3.6pl中分選出CD133+細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其具備高成瘤、自我更新和多向分化特性。流式分析術(shù)發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞約占人胰腺癌組織中癌細(xì)胞總數(shù)的1%～3%，在大多數(shù)人胰腺癌細(xì)胞系中其含量低于1%，并發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞與CD44+CD24+ESA+細(xì)胞之間存在14%的重疊。他們認(rèn)為，CD133+細(xì)胞可能是另一種表型的PCSCs。這一結(jié)果驗(yàn)證了Olempska等[6]的推論，他們檢測(cè)了5株人胰腺癌細(xì)胞株CSCs標(biāo)志物的表達(dá)，分析認(rèn)為CD133和(或)ABCG2陽性可能代表PCSCs。最近，Rasheed等[7]報(bào)道，ALDH+胰腺癌細(xì)胞可能是另一種表型的PCSCs。這種表型的胰腺癌細(xì)胞在體外克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力是未分選胰腺癌細(xì)胞和ALDH-細(xì)胞的5～11倍，其與CD44+CD24+細(xì)胞之間僅存在極少量的重疊。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ALDH+CD44+CD24+細(xì)胞較ALDH+和CD44+CD24+細(xì)胞致瘤能力更強(qiáng)，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。遺憾的是他們沒有研究ALDH+與CD133+細(xì)胞之間的關(guān)系。上述研究結(jié)果提示，根據(jù)目前CSCs的鑒別手段和判定標(biāo)準(zhǔn)，胰腺癌中可能存在不同表型的CSCs。

二、PCSCs與胰腺癌轉(zhuǎn)移

2005年Saur等[8]報(bào)道，趨化因子受體4(CXCR4)的表達(dá)可顯著增加胰腺癌肝、肺轉(zhuǎn)移，AMD3100可阻止其轉(zhuǎn)移潛能。Hermann等[5]發(fā)現(xiàn)，雖然CD133+CXCR4-和CD133+CXCR4+胰腺癌細(xì)胞都能在無胸腺小鼠體內(nèi)形成原發(fā)病灶，但只有CD133+CXCR4+細(xì)胞能形成轉(zhuǎn)移灶，去除這部分細(xì)胞，胰腺癌的轉(zhuǎn)移特性被廢除，給予CXCR4抑制劑AMD3100其轉(zhuǎn)移能力也大大降低。他們還發(fā)現(xiàn)，CD133+CXCR4+亞群所占比例越大，胰腺癌越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，這部分細(xì)胞被認(rèn)為是遷移性胰腺癌干細(xì)胞(mPCSCs)。最新研究表明[7]，ALDH+表型PCSCs可能富含mPCSCs。ALDH+和CD44+CD24+細(xì)胞之間的成瘤能力差異不大，但在遷移能力方面則表現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性。ALDH+細(xì)胞在體外的遷移和侵襲能力是未分選胰腺癌細(xì)胞的3倍，CD44+CD24+細(xì)胞僅表現(xiàn)出輕微增加。ALDH+CD44+CD24+胰腺癌細(xì)胞更具侵襲性。臨床研究也證實(shí)[7]，胰腺癌轉(zhuǎn)移灶中ALDH表達(dá)率更高，原發(fā)灶A(yù)LDH表達(dá)陽性者更容易發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處臟器如肝、肺的轉(zhuǎn)移。抑制Shh Hegerhog信號(hào)途徑可以清除ALDH+PCSCs，從而使胰腺癌在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降[9]。目前尚需進(jìn)一步研究ALDH+與CD133+CXCR4+細(xì)胞之間的關(guān)系。

三、PCSCs與治療抵抗

CSCs通常具備以下特征[3,10-11]：多處于G0期；具有抗凋亡活性；具備強(qiáng)大的DNA修復(fù)能力；高表達(dá)耐藥蛋白；某些信號(hào)途徑如Wnt/β-catenin、Notch等的激活等。因此，CSCs更加耐受常規(guī)治療，PCSCs也不例外。研究表明[5-6,12]，不論是CD133+還是CD44+CD24+ESA+表型的PCSCs，都能耐受放、化療。胰腺癌細(xì)胞系在體外接受健擇干預(yù)后，CD133+和CD44+細(xì)胞含量顯著增加[5,13]。放射治療和健擇化療都能顯著富集荷瘤鼠CD133+、CD44+CD24+ESA+和ALDH+細(xì)胞[5,12]。我們的研究也顯示[14]，放化療抵抗的胰腺癌細(xì)胞系干細(xì)胞標(biāo)志物Oct-4、ABCG2表達(dá)增加，體外克隆形成能力增強(qiáng)，在無胸腺小鼠皮下成瘤能力也更強(qiáng)；放化療抵抗的胰腺癌細(xì)胞系SW1990中CD24表達(dá)增加，說明治療抵抗的胰腺癌細(xì)胞中富含PCSCs。深入研究PCSCs耐受放化療的機(jī)制將有助于發(fā)掘出針對(duì)PCSCs的治療手段。

四、PCSCs與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

所謂EMT，是指上皮表型細(xì)胞在特定生理和病理情況下向間充質(zhì)表型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，幾個(gè)與胚胎發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist等通過抑制E-cad的轉(zhuǎn)錄在EMT的誘導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15-16]。

EMT與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。最近研究表明[7]，ALDH的表達(dá)與人胰腺癌淋巴結(jié)、肝和肺的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而ALDH+胰腺癌細(xì)胞同時(shí)具備干細(xì)胞特征和間質(zhì)表型特征。與未分選細(xì)胞比，CDH1(其編碼產(chǎn)物即E-cad)基因在ALDH+細(xì)胞中表達(dá)下降一半，在ALDH+CD44+CD24+細(xì)胞中下降90%；Slug在ALDH+細(xì)胞中表達(dá)增加51倍,而在ALDH+CD44+CD24+細(xì)胞中增加73倍。在EMT的誘導(dǎo)中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1對(duì)CSCs“干性”的維持起重要作用。研究表明[18]，ZEB1敲除后可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞球囊形成能力和成瘤能力下降，侵襲和轉(zhuǎn)移能力也下降，還導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物更敏感，干細(xì)胞因子Sox2、Bmi1和p63表達(dá)下調(diào)，穩(wěn)定敲除后CD24mRNA表達(dá)下調(diào)。ZEB1可能通過對(duì)微小RNA(miRNAs)的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)對(duì)CSCs“干性”的維持。某些miRNAs也參與CSCs“干性”的調(diào)控，下調(diào)其中起抑制“干性”作用的miRNAs的表達(dá)即可以維持干細(xì)胞表型。miR-200家族成員(miR-141,miR-200a、b、c和miR-429)的靶基因包括維持胚胎干細(xì)胞表型的分子，如Sox2、KLF4和Bmi1，因此，其可誘導(dǎo)細(xì)胞分化。它們還可以通過抑制ZEB1/2mRNA的轉(zhuǎn)錄來抑制EMT的發(fā)生，而ZEB1也可以抑制miR-200家族成員的表達(dá)，它們之間相互作用形成一個(gè)負(fù)反饋環(huán)。因此，ZEB1可通過抑制miR-200家族成員的表達(dá)而在維持“干性”中發(fā)揮重要作用。此外，ZEB1還可以通過抑制另一個(gè)重要的“干性”抑制因子miR-203的表達(dá)來維持胰腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的腫瘤起始能力，并促進(jìn)mPCSC的生成。

EMT還與胰腺癌治療抵抗有關(guān)。Wellner、Shah、Wang等[19-21]發(fā)現(xiàn)健擇耐受的多株胰腺癌細(xì)胞系發(fā)生了EMT。我們的研究也發(fā)現(xiàn)[22]，放化療抵抗的胰腺癌細(xì)胞系富含干細(xì)胞樣癌細(xì)胞，同時(shí)其也發(fā)生了EMT。有研究表明，健擇耐受的胰腺癌細(xì)胞系發(fā)生EMT與Notch通路的激活有關(guān)[20]，而Notch通路是重要的干細(xì)胞信號(hào)通路之一。治療抵抗誘導(dǎo)的EMT與PCSCs之間可能存在密切而復(fù)雜的關(guān)系。一方面，某些表型的PCSCs本身即可能表現(xiàn)為間質(zhì)表型,并且PCSCs可能具備更強(qiáng)的EMT和MET相互轉(zhuǎn)化的可塑性。如Kabashima等[23]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞系來源的側(cè)群(SP)細(xì)胞具備更強(qiáng)的EMT和MET相互轉(zhuǎn)化的可塑性。SP細(xì)胞被認(rèn)為是具有干細(xì)胞特性的一類細(xì)胞。另一方面，在治療選擇壓力下，CSCs自我更新受到抑制，放化療富集PCSCs可能不僅僅是簡單的通過殺死敏感的癌細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，治療抵抗誘導(dǎo)的EMT可能促進(jìn)了PCSCs和mPCSCs的產(chǎn)生,分化相對(duì)成熟的癌細(xì)胞和PCSCs可能通過EMT和MET過程達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。兩個(gè)獨(dú)立的研究小組在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)[24-25]，乳腺癌細(xì)胞在經(jīng)歷EMT后獲得了與干細(xì)胞類似的特征，他們認(rèn)為誘導(dǎo)EMT促進(jìn)了乳腺癌干細(xì)胞的產(chǎn)生。Vesuna等[26]的最新研究表明，與EMT密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Twist可以下調(diào)CD24的表達(dá)而促使乳腺癌干細(xì)胞的生成。在胰腺癌中，治療抵抗誘導(dǎo)的EMT是否促進(jìn)了PCSCs和mPCSCs的生成還有待于深入研究。

五、針對(duì)PCSCs的治療策略

在充分了解CSCs自我更新機(jī)制的基礎(chǔ)上，選擇性阻斷其信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)可以促使CSCs分化或誘導(dǎo)其凋亡，這種CSCs特異性的分化和消除治療有望從源頭上控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，從而獲得顯著的療效。此外，CSCs特異性表面標(biāo)志也是潛在的治療靶標(biāo)。

1．針對(duì)PCSCs自我更新途徑的治療：Li等[4]發(fā)現(xiàn)CD44+CD24+ESA+PCSCs中存在Shh途徑的激活，與正常胰腺上皮細(xì)胞相比，該表型PCSCs中Shh mRNA表達(dá)增加了46倍，而未分選的腫瘤細(xì)胞僅增加4倍。因此，針對(duì)Shh途徑的治療有可能對(duì)胰腺癌的治療有益。轉(zhuǎn)錄因子神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤相關(guān)抗原-1(glioma-associated antigen-1,Gli-1)介導(dǎo)了Shh途徑的激活，針對(duì)Gli1 mRNA的3′非編碼區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)可有效抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡[27]。Feldmann等[9]發(fā)現(xiàn)，裸鼠移植瘤經(jīng)過健擇治療后，ALDH表達(dá)明顯增高，聯(lián)合應(yīng)用Shh抑制劑環(huán)杷明(cyclopamine)后，ALDH減少三分之二。這表明Shh途徑被抑制后，PCSCs自我更新受抑制。但單獨(dú)環(huán)杷明治療并不能完全廢除其致瘤性，說明PCSCs中還存在其他信號(hào)途徑的激活并參與其自我更新。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)途徑對(duì)維持CSCs的自我更新是必需的。p70s6激酶是mTOR下游的靶基因，其激活被認(rèn)為是該通路激活的可靠標(biāo)志[28]，p70s6激酶活化后可磷酸化其下游的核糖體S6蛋白(s6 ribosomal protein,s6rp)。Mueller等[29]分析胰腺癌組織中s6rp的磷酸化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)包括CD133+PCSCs在內(nèi)的少部分胰腺癌細(xì)胞中mTOR途徑激活。于是他們應(yīng)用Shh途徑抑制劑(環(huán)杷明/CUR199691)和mTOR阻斷劑雷帕霉素及健擇治療胰腺癌。結(jié)果顯示三聯(lián)治療可在體內(nèi)外清除CD133+和CD24+CD44+ESA+細(xì)胞，還可以清除SP細(xì)胞，并且荷瘤鼠可以耐受三藥聯(lián)用，其生存期顯著延長。而單獨(dú)應(yīng)用環(huán)杷明或雷帕霉素或加健擇雖然都可以導(dǎo)致CD133下降，但都不足以清除PCSCs。此外，他們還發(fā)現(xiàn)三聯(lián)治療還可以針對(duì)mPCSCs。單獨(dú)給予健擇或雷帕霉素或二者聯(lián)用都不能顯著減少胰腺癌細(xì)胞的遷移性，單獨(dú)使用環(huán)杷明雖然可以顯著降低其遷移能力，但必須和健擇聯(lián)用才能完全廢除其遷移性。流式分析術(shù)發(fā)現(xiàn)，給予健擇后同樣導(dǎo)致CD133+CXCR4+mPCSCs富集，而只有環(huán)杷明和健擇聯(lián)用或三聯(lián)治療才能完全清除CD133+CXCR4+亞群。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，健擇預(yù)處理過的胰腺癌細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)移，而環(huán)杷明預(yù)處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)移減少。健擇和環(huán)杷明二聯(lián)預(yù)處理進(jìn)一步減少，三聯(lián)處理后不能成瘤及發(fā)生轉(zhuǎn)移。

2．針對(duì)某些miRNAs的治療：受p53調(diào)控的miR-34，其靶蛋白是Notch通路蛋白和Bcl-2，它在CSCs的維持和生存中也可能起作用。Ji等[30]發(fā)現(xiàn)，p53突變的人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaCa2來源的CD44+/CD133+細(xì)胞高表達(dá)Notch/Bcl-2，而miR-34表達(dá)缺失。重建miR-34的表達(dá)不僅可以下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中Bcl-2和Notch1/2的表達(dá)，還誘導(dǎo)其凋亡和細(xì)胞周期阻滯，增強(qiáng)化、放療敏感性，并顯著抑制腫瘤的克隆形成和侵襲，其致瘤性也顯著下降，流式分析術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD44+/CD133+細(xì)胞減少87%。該結(jié)果顯示miR-34可能通過下調(diào)Bcl-2和Notch而在PCSCs的自我更新和(或)細(xì)胞命運(yùn)決定中起重要作用。因此，對(duì)于缺乏p53-miR34的胰腺癌重建miR-34的表達(dá)可能具有重要意義。另外，針對(duì)ZEB1-miR-200反饋環(huán)的治療對(duì)胰腺癌而言可能是有效的治療途徑[19]。

3．針對(duì)PCSCs表面標(biāo)志物的的靶向性治療：Salnikov等[31]應(yīng)用針對(duì)PCSCs標(biāo)志物——上皮黏附分子(EpCAM)的雙特異性抗體EpCAMxCD3 能明顯地延緩胰腺癌細(xì)胞株BxPC3移植瘤在SCID鼠上的生長。提示針對(duì)PCSCs表面標(biāo)志物的靶向性治療也是值得進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

4．針對(duì)EMT-PCSCs的治療：由于PCSCs本身即可能表現(xiàn)為間質(zhì)表型，且分化相對(duì)成熟的癌細(xì)胞和PCSCs可能通過EMT和MET過程相互轉(zhuǎn)化，因此發(fā)現(xiàn)與CSCs和EMT相關(guān)的分子信息有助于開發(fā)新的針對(duì)CSCs和EMT的藥物，逆轉(zhuǎn)其間質(zhì)表型將有助于增強(qiáng)其對(duì)傳統(tǒng)治療的敏感性[32-33]。

此外，胰腺癌富含基質(zhì)成分，且處于低氧狀態(tài)，間質(zhì)成分和低氧微環(huán)境都參與了胰腺癌的放化療耐受。并且低氧可以富集CSCs，并促進(jìn)CSCs“干性”的維持和阻止其分化。因此，腫瘤微環(huán)境尤其是低氧微環(huán)境對(duì)PCSCs及治療的影響也值得進(jìn)一步深入研究。

六、PCSCs標(biāo)志物對(duì)胰腺癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的判斷

Maeda等[34]發(fā)現(xiàn)，CD133的表達(dá)與人胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后差有關(guān)。Welsch等[35]認(rèn)為，CD133和CXCR4的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)無關(guān)。Rasheed等[7]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌原發(fā)病灶A(yù)LDH的表達(dá)與腫瘤大于3 cm、腫瘤分化程度低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此，原發(fā)灶A(yù)LDH表達(dá)陽性的患者預(yù)后更差，與原發(fā)灶A(yù)LDH表達(dá)陰性的患者相比，其中位生存期下降22%(14個(gè)月對(duì)18個(gè)月)。Hong等[13]的結(jié)果表明，胰腺癌CD44陽性提示預(yù)后差，CD44陽性者中位生存期短于CD44陰性者(16.9個(gè)月對(duì)25.3個(gè)月)。不同表型PCSCs對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后的影響可能不同，不同的PCSCs標(biāo)志物對(duì)預(yù)后及復(fù)發(fā)的判斷價(jià)值也可能存在差異，因此還需要做大量前瞻性研究。

總之，深入了解PCSCs生物學(xué)行為及相關(guān)的分子調(diào)控途徑，將促進(jìn)對(duì)胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及耐受常規(guī)治療的研究，為胰腺癌的治療帶來新的策略。

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2010-05-05)

(本文編輯：屠振興)

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