紫杉醇所致SD大鼠外周神經(jīng)病變模型的建立

遲曉麗，邵 璇，周文霞，張永祥

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

化療藥誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病變（chemotherapyinduced peripheral neuropathy，CIPN）［1］是多種化療藥物的共同而嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如鉑類、紫杉酚類、埃博霉素、長(zhǎng)春花屬生物堿類，以及硼替佐米（bortezomib）和來(lái)那度胺（lenolidamide）等新上市的化療藥，主要表現(xiàn)為感受神經(jīng)元異常和神經(jīng)痛。CIPN目前已成為腫瘤化療中最主要的劑量限制因素之一［1］，嚴(yán)重影響了化療藥的療效。如，高居世界抗腫瘤藥物銷售額之首的紫杉醇類藥物在臨床使用中所導(dǎo)致的外周神經(jīng)病變并不會(huì)隨著停藥而得到緩解，而是持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，并且對(duì)目前臨床上所使用的任何鎮(zhèn)痛藥物都不敏感，常導(dǎo)致一部分患者被迫減量直至停藥，從而影響化療效果甚至使化療歸于失敗，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量［2］。目前尚無(wú)有效的 CIPN治療藥物問(wèn)世。因此，建立CIPN動(dòng)物模型并在此基礎(chǔ)上研制可以緩解甚至治愈CIPN的藥物是當(dāng)務(wù)之急。近十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在建立CIPN動(dòng)物模型上進(jìn)行了諸多嘗試，取得了明顯進(jìn)展，其中最常用的是使用PTX腹腔注射建立成年雄性SD大鼠外周神經(jīng)病變模型［3］。但是關(guān)于影響CIPN模型建立的相關(guān)因素卻少有涉及，在此基礎(chǔ)上篩選和評(píng)價(jià)CIPN藥物的研究更是鳳毛麟角。本研究擬考察影響PTX所致SD大鼠CIPN模型的影響因素，為篩選和研究防治CIPN藥物提供理想的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，雄性，180～220 g，350～400 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（軍）2002-001］。每2只飼養(yǎng)于不銹鋼絲籠中，自由攝食飲水。

1.1.2 藥品及試劑：紫杉醇，購(gòu)自北京華素制藥股份有限公司，批號(hào)0810201。溶劑聚氧乙基蓖麻油/無(wú)水乙醇（1∶1）由茹祥斌教授提供。兔抗人PGP9.5多抗，Abcam公司，美國(guó)；小鼠抗大鼠MHC class IIRT la（OX-6）單抗，Abcam公司，美國(guó)；Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG，BioLegend公司，美國(guó)；FITC標(biāo)記驢抗小鼠IgG，Santa Cruz公司，美國(guó)。

1.1.3 動(dòng)物分組及給藥：動(dòng)物分為溶劑對(duì)照組和給藥組，每組2～9只動(dòng)物。紫杉醇以1∶1的聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor，CrEL）和無(wú)水乙醇做為溶媒，隔日一次腹腔注射給藥，2 mg·kg-1·次共注射4次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 機(jī)械致痛行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和給藥由不同的實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行。大鼠放在抬高的鐵絲網(wǎng)上，每只大鼠使用一個(gè)透明的有機(jī)玻璃盒（30 cm×20 cm ×15 cm）將其罩在下方，限制其活動(dòng)范圍于此玻璃盒內(nèi)，任其自由活動(dòng)5 m in后開(kāi)始行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。機(jī)械性異常性疼痛、機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏分別通過(guò)4 g和15 g折力的測(cè)痛絲進(jìn)行測(cè)試。每只大鼠測(cè)試時(shí)都遵循折力由小到大的順序進(jìn)行。測(cè)痛絲刺激大鼠后足掌底中部（避開(kāi)突起部位）5 s，每種折力的測(cè)痛絲刺激每只后足5次，每只大鼠共刺激10次。每只大鼠兩只后足對(duì)4 g、15 g測(cè)痛絲刺激的反應(yīng)次數(shù)和總刺激次數(shù)的百分比分別作為該只大鼠的機(jī)械性異常性疼痛、機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏的程度。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表皮下神經(jīng)纖維：SD大鼠腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥鈉。先用含有0.05％ 碳酸氫鈉和0.1％亞硝酸鈉的PBS快速灌流1 m in，然后灌流250 m L新鮮配置的PB（0.1 M，含4％多聚甲醛，pH 7.4）30 min。切斷SD大鼠后足，在上述固定液中固定過(guò)夜。次日取SD大鼠后足底的一塊遠(yuǎn)離跟骨、靠近足底突起的皮膚，在含30％蔗糖的PB溶液中4％冷藏保存過(guò)夜。包埋冷凍后低溫恒溫切片（30μm）。在含有10％普通驢血清的PBS+T中室溫孵育1 h。使用含有5％普通驢血清的rabbit anti-human PGP9.5一抗（1∶6400稀釋）4℃孵育24 h。PBS+T清洗后，donkey antirabbit IgG二抗 Cy3標(biāo)記（1∶200稀釋）孵育1.5 h。mouse anti-rat MHC class II RT la（OX-6）一抗（1∶400稀釋）孵育1.5 h。PBS+T清洗后，donkey antimouse IgG二抗FITC標(biāo)記（1∶30稀釋）孵育1.5 h。使用熒光顯微鏡10x和20x物鏡，觀察和表皮相連的表皮下神經(jīng)纖維 （intraepidermal nerve fiber，IENF）的形態(tài)和數(shù)目，IENF沒(méi)有最短長(zhǎng)度要求，在表皮內(nèi)分支的IENF計(jì)為1根。

1.2.3 電鏡檢測(cè)坐骨神經(jīng)細(xì)胞線粒體：大鼠如上述方法固定后取大腿中部約5 mm的坐骨神經(jīng)，在上述固定液中固定3h。將組織轉(zhuǎn)移至含有10％蔗糖的0.1M PB中，在4℃放置至少12 h。將組織轉(zhuǎn)移至含1％四氧化餓的0.1M PB（pH7.4）中，在4℃放置2 h。室溫下，在濃度梯度上升的乙醇和環(huán)氧丙烷中將組織脫水。隨后將組織包埋于環(huán)氧樹(shù)脂中。使用鉆石刀頭的超薄切片機(jī)制作70 nm切片，F(xiàn)ormvar包裹的網(wǎng)收集超薄切片。將切片進(jìn)行檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾染色。將切片置于80kV的電鏡下鏡檢，3130x用于觀察大致情況，24400x用于線粒體計(jì)數(shù)。

從表2可以看出，處理能增加西瓜坐果率、提高單瓜重、每公頃產(chǎn)量提高4617 kg、處理比對(duì)照每公頃產(chǎn)量提高了15.8%，中心糖度提高了2.4度。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS v18.0軟件進(jìn)行具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PTX對(duì)SD大鼠一般情況的影響

實(shí)驗(yàn)期間未觀察到5組大鼠出現(xiàn)脫毛、腹瀉、運(yùn)動(dòng)失常等情況。每2 d或3d測(cè)定大鼠體重一次。從圖1（A）和（B）的體重動(dòng)態(tài)觀測(cè)表中可以看出，腹腔注射4次2 mg/kg PTX對(duì)SD大鼠的體重增長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。

2.2 PTX對(duì)SD大鼠機(jī)械性異常性疼痛的影響

從圖2（A）、（B）可以看出，經(jīng)2 mg/kgPTX腹腔注射4次處理后，實(shí)驗(yàn)全程均沒(méi)有觀察到初始體重200 g的SD大鼠有明顯的機(jī)械性異常性疼痛，但在17 d可以觀察到初始體重400 g的SD大鼠有明顯的機(jī)械性異常性疼痛。

2.3 PTX對(duì)SD大鼠異常性疼痛過(guò)敏的影響

2.4 PTX對(duì)SD大鼠后足表皮下神經(jīng)纖維的影響

對(duì)大鼠后足表皮切片進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)，IENF圖4中粗紅線是表皮，表皮下的亮紅色絲狀物即PGP9.5抗體標(biāo)記的IENF。從圖4（彩插2）中可以看出，對(duì)照組SD大鼠表皮下IENF分布均勻且數(shù)量較多，但卻幾乎觀察不到紫杉醇模型組SD大鼠的表皮下IENF的存在。表明，PTX處理后會(huì)導(dǎo)致SD大鼠后足表皮下IENF斷裂，IENF密度顯著降低（圖5）。

2.5 PTX對(duì)SD大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞線粒體的影響

圖6中箭頭表示正常線粒體，帶橫線的箭頭表示空泡變性的異常線粒體。從圖5中可以看出，對(duì)照組SD大鼠的坐骨神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)元軸突中正常線粒體的比例較高，異常線粒體較少，而PTX處理后空泡變性的異常線粒體明顯增多。

圖1 紫杉醇對(duì)SD大鼠體重的影響。（A）初始體重200 g SD大鼠；（B）初始體重400 g SD大鼠。Mean±SD，n=2-9。其中對(duì)照組2只，模型組9只SD大鼠

3 討論

紫杉醇最先是從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的樹(shù)皮中分離出來(lái)的治療實(shí)體瘤的最有效和最常用的化療藥物之一。其常見(jiàn)的毒副作用有三種：骨髓抑制、腎毒性和外周神經(jīng)毒性。骨髓抑制和腎毒性可以通過(guò)粒細(xì)胞集落刺激因子和大量飲水而分別得到很好的改善。但是，由于缺乏對(duì)其治病機(jī)制的了解和有效的治療方法，紫杉醇的外周神經(jīng)毒性仍然是其嚴(yán)重的劑量限制因素。紫杉醇可導(dǎo)致患者的感受神經(jīng)元異常和神經(jīng)痛等的嚴(yán)重的化療藥所致外周神經(jīng)病變，包括機(jī)械性異常性疼痛、機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏、冷敏異常性疼痛、持續(xù)性灼燒痛、麻刺感和麻木等癥狀，并且這些癥狀不會(huì)隨著化療藥的停藥而得到緩解，而是持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年［2］。同時(shí)由于CIPN多對(duì)目前臨床上所使用的鎮(zhèn)痛藥物不敏感，常導(dǎo)致一部分患者被迫減少化療藥的劑量甚至停藥，從而影響化療效果甚至使化療歸于失敗。迄今為止，CIPN發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未完全闡明，也沒(méi)有可以有效緩解或治療CIPN的藥物問(wèn)世［4，5］。

圖2 紫杉醇致SD大鼠機(jī)械性異常性疼痛的動(dòng)態(tài)觀測(cè)圖。（A）初始體重200 g的SD大鼠組；（B）初始體重400 g的SD大鼠組。Mean±SD，n=2-9，其中對(duì)照組2只，模型組9只SD大鼠。＊＊P＜0.01，和對(duì)照組相比。

圖3 紫杉醇致SD大鼠機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏的動(dòng)態(tài)觀測(cè)圖。（A）初始體重200g的SD大鼠組；（B）初始體重400g的SD大鼠組。Mean±SD，n=2-9。其中對(duì)照組2只，模型組9只SD大鼠。＊＊P＜0.01*P＜0.05，和對(duì)照組比

圖5 紫杉醇對(duì)SD大鼠表皮下神經(jīng)纖維密度的影響。Mean±SD，n=3，＊＊P＜0.01，與對(duì)照組比。

圖6 紫杉醇對(duì)SD大鼠坐骨神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)元軸突異常線粒體的影響。電鏡鏡檢SD大鼠坐骨神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)元軸突線粒體，20000×～40000×。箭頭表示正常線粒體，帶橫線的箭頭表示空泡變性的異常線粒體。（A）對(duì)照組；（B）PTX組

有國(guó)外學(xué)者應(yīng)用紫杉醇腹腔注射建立SD大鼠外周神經(jīng)病變模型，但各種模型的建立條件及方法（如給藥劑量、給藥頻率、動(dòng)物品系、測(cè)定方法等）差別很大。值得注意的是，不同品種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在篩選CIPN有效藥物時(shí)可能有不同的表現(xiàn)，從而得出不同的結(jié)論。有少量文獻(xiàn)采用了 W istar大鼠、C57BL/6和 ddY等小鼠作為模型動(dòng)物［4-8］。本實(shí)驗(yàn)室也曾嘗試使用小鼠作為CIPN的模型動(dòng)物，但前期工作表明，KM小鼠并不適合用作該病癥的模型動(dòng)物，因?yàn)镵M鼠活潑好動(dòng)，放置在帶鐵絲網(wǎng)的高架臺(tái)上30 m in后仍未處于靜息狀態(tài)，若此時(shí)強(qiáng)行進(jìn)行行為學(xué)測(cè)痛實(shí)驗(yàn)，恐不能正確反映小鼠的痛覺(jué)狀態(tài)。而C57BL/6的情況則稍好些，在大約30 m in時(shí)就進(jìn)入靜息狀態(tài)，但仍比SD大鼠耗時(shí)（5min）要長(zhǎng)。由于使用小鼠建立的 CIPN模型持續(xù)時(shí)間短（4～5 d）［7］，和臨床 CIPN癥狀的長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)（～3個(gè)月）有相當(dāng)大的差距，因此小鼠用作CIPN模型動(dòng)物是否能夠準(zhǔn)確反映臨床癥狀還是值得懷疑的。

目前較多采用的是SD大鼠作為CIPN模型動(dòng)物。Sarah J.L.Flatters等采用大鼠腹腔隔日（0，2，4，6 d）注射2 mg/kg紫杉醇，總計(jì)8 mg/kg［9-11］。陳治軍等采用大鼠腹腔隔日（1，3，5，7 d）注射1 mg/ kg紫杉醇，總計(jì) 4 mg/kg［12］。據(jù)報(bào)道，紫杉醇致外周神經(jīng)病變屬劑量限制性毒性，沒(méi)有量效關(guān)系，因此選擇能觀察到明顯病變且未出現(xiàn)明顯全身毒性的劑量為佳。本研究對(duì)大鼠采用2 mg/kg隔日注射共4次的方法，觀察到初始體重為400 g的大鼠表現(xiàn)出神經(jīng)病變，并且其后足IENF斷裂、密度明顯降低表明外周神經(jīng)病變程度嚴(yán)重，而此時(shí)大鼠體重并未發(fā)生明顯變化，表明造模劑量合適。

目前研究CIPN的方法包括機(jī)械縮足反射（分為特定刺激力度縮足比率、縮足閾值測(cè)定兩種方式檢測(cè)）、熱敏實(shí)驗(yàn)（熱板反射）和冷敏實(shí)驗(yàn)（丙酮實(shí)驗(yàn)）。陳治軍等使用的是機(jī)械縮足反射（縮足閾值測(cè)定）和熱敏實(shí)驗(yàn)方法［12］；Shad B.Sm ith等通過(guò)考察10種封閉群小鼠的紫杉醇致外周神經(jīng)病變模型建立可行性，發(fā)現(xiàn)該10種小鼠對(duì)熱敏均不敏感，而對(duì)機(jī)械縮足反射（特定刺激力度縮足比率）及冷敏實(shí)驗(yàn)非常敏感［8］；Sarah J.L.Flatters等同樣單獨(dú)采用機(jī)械縮足反射（特定刺激力度縮足比率）或連同冷敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察［5，9，10，11］。Elizabeth J.Rahn等采用機(jī)械縮足反射法測(cè)定縮足閾值［13］。日本學(xué)者Takao Hidaka等考察芍藥甘草湯對(duì)紫杉醇致外周神經(jīng)病變的改善效果時(shí)采用的是改進(jìn)過(guò)的機(jī)械縮足反射方法（特定刺激力度縮足比率）［7］。我們對(duì)各種文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，采用機(jī)械縮足反射測(cè)定特定刺激力度縮足比率的報(bào)道最多，該實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)（約為20～30 d）［5，9，10，11］，更能模擬臨床狀態(tài)，結(jié)果更可靠；而采用機(jī)械縮足反射測(cè)定縮足閾值的報(bào)道略少，且實(shí)驗(yàn)周期較短（5～7 d），更適合作為預(yù)實(shí)驗(yàn)或CIPN藥物的篩選和初步評(píng)價(jià)。本研究即選擇了更能模擬臨床狀態(tài)的機(jī)械縮足反射測(cè)定特定刺激力度縮足比率的方法。

采用機(jī)械縮足反射法測(cè)定大鼠疼痛常用4-15 g折力的測(cè)痛絲。由于正常大鼠受到4 g折力測(cè)痛絲的刺激很少發(fā)生縮足反射，而CIPN模型大鼠受到4 g折力的刺激會(huì)出現(xiàn)明顯的縮足反射，因此4 g折力對(duì)大鼠足底的刺激所引起的反應(yīng)最能夠代表機(jī)械性異常性疼痛。正常大鼠受到15 g折力的測(cè)痛絲刺激后有大約5～20％的幾率發(fā)生縮足反射，而CIPN模型大鼠受到15 g折力的刺激出現(xiàn)縮足反射的幾率顯著增加，因此15 g折力的測(cè)痛絲對(duì)大鼠足底的刺激所引起的反應(yīng)最能代表機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏［5］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用同樣劑量的紫杉醇、同樣的給藥方式和給藥頻率的情況下，體重在350～400 g之間的SD大鼠比180～220 g之間的 SD大鼠所表現(xiàn)出來(lái)的外周神經(jīng)病變程度更為嚴(yán)重、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，更適合于進(jìn)行治療藥物篩選和評(píng)價(jià)。至于初始體重400g左右的SD大鼠對(duì)紫杉醇所致外周神經(jīng)病變更為敏感的原因，我們分析認(rèn)為，可能是由于初始體重400g的SD大鼠的有效劑量較大，也可能與老年大鼠對(duì)化療藥所致外周神經(jīng)病變更為敏感有關(guān)，還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，給予初始體重400g的SD大鼠隔日腹腔注射2 mg/kg的PTX共4次的方法成功建立了紫杉醇致外周神經(jīng)病變動(dòng)物模型，與臨床 CIPN患者所表現(xiàn)出來(lái)的典型癥狀和長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的特征一致，該模型能夠較為準(zhǔn)確地模擬臨床相關(guān)癥狀。本研究報(bào)道了體重/月齡、造模藥物劑量可能對(duì)紫杉醇致SD大鼠外周神經(jīng)病變模型有重要影響，為篩選緩解紫杉醇和長(zhǎng)春新堿所致外周神經(jīng)病變的藥物建立相對(duì)穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型，并為探討CIPN發(fā)生的機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。

［1］Wolf S，Barton D，Kottschade L，Grothey A，Loprinzi C.Chemotherapy-induced peripheral neuropathy：prevention and treatment strategies［J］.Eur JCancer.2008，44（11）：1507-1515.

［2］Kawashiri T，Egashira N，Itoh Y，Shimazoe T，Ikegami Y，Yano T，Yoshimura M，Oishi R.Neurotropin reverses paclitaxelinduced neuropathy without affecting anti-tumour efficacy［J］.Eur JCancer.2009，45（1）：154-163.

［3］Lacouture ME，Melosky BL.Cutaneous reactions to anticancer agents targeting the epidermal growth factor receptor： a dermatology-oncology perspective［J］.Skin Therapy Lett.2007，12（6）：1-5.

［4］Pascual D， Goicoechea C， Burgos E， Martín MI.Antinociceptive effect of three common analgesic drugs on peripheral neuropathy induced by paclitaxel in rats［J］.Pharmacol Biochem Behav.2010，95（3）：331-337.

［5］Flatters SJ，Bennett GJ.Ethosuxim ide reverses paclitaxel-and vincristine-induced painful peripheral neuropathy［J］.Pain.2004，109（1-2）：150-161.

［6］Gauchan P，Andoh T，Kato A，Sasaki A，Kuraishi Y.Effects of the prostaglandin E1 analog limaprost on mechanical allodynia caused by chemotherapeutic agents in mice［J］.J Pharmacol Sci.2009，109（3）：469-472.

［7］Hidaka T，Shima T，Nagira K，Ieki M，Nakamura T，Aono Y，Kuraishi Y，Arai T，Saito S.Herbalmedicine Shakuyaku-kanzoto reduces paclitaxel-induced painful peripheral neuropathy in mice［J］.Eur JPain.2009，13（1）：22-27.

［8］Smith SB，Crager SE，Mogil JS.Paclitaxel-induced neuropathic hypersensitivity in mice responses in 10 inbred mouse strains［J］.Life Sci.2004，74（21）：2593-2604.

［9］Flatters SJ，Xiao WH，Bennett GJ.Acetyl-L-carnitine prevents and reduces paclitaxel-induced painful peripheral neuropathy［J］.Neurosci Lett.2006，397（3）：219-223.

［10］Jin HW，F(xiàn)latters SJ，Xiao WH，Mulhern HL，Bennett GJ. Prevention of paclitaxel-evoked painful peripheral neuropathy by acetyl-L-carnitine effects on axonal mitochondria，sensory nerve fiber terminal arbors［J］.Exp Neurol.2008，210（1）：229-237.

［11］Xiao WH，Bennett GJ.Chemotherapy-evoked neuropathic pain Abnormal spontaneous discharge in A-fiber and C-fiber primary afferent neurons and its suppression by acetyl-L-carnitine［J］.Pain.2008，135（3）：262-270.

［12］陳治軍，田玉科，羅放，曹菲，王平.紫杉醇致大鼠外周神經(jīng)病理性疼痛模型的建立［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，37（6）：785-790.

［13］Rahn EJ，Zvonok AM，Thakur GA，Khanolkar AD，Makriyannis A，Hohmann AG.Selective activation of cannabinoid CB2 receptors suppresses neuropathic nociception induced by treatment with the chemotherapeutic agent paclitaxel in rats［J］.JPharmacol Exp Ther.2008，327（2）：584-591.