丁 聰,馮 潔,謝建云,高 誠,3,胡建華
(1.揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心,揚(yáng)州 225009;2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站,上海 201203; 3.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所,上海 200032)
螺桿菌菌屬(Helicobacter spp.)是一組最初從人類和其他哺乳動(dòng)物胃中分離出來的革蘭氏陰性、微需氧、螺旋彎曲狀細(xì)菌,其中具有代表性的是H.pylori。根據(jù)它們喜好的定居部位,可被分為胃螺桿菌和腸肝螺桿菌(enterohepatic helicobacter species,EHS)[1]。自1992年Lee等人發(fā)現(xiàn)了鼠型螺桿菌以來,已從嚙齒類動(dòng)物腸道中分離出了大量的螺桿菌屬新菌株。目前,已有20余種寄生于某些動(dòng)物和人類胃腸道且有致病性的螺桿菌被正式命名。對嚙齒類而言,有肝型(H.hepacticus)、鼠型(H.muridarum)和膽型(H.bilis)。嚙齒類螺桿菌以隱性感染的形式廣泛存在于實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠中[1],被感染動(dòng)物大多數(shù)以慢性、潛伏性感染為主,無明顯癥狀?,F(xiàn)已有研究顯示這類細(xì)菌不僅在人或動(dòng)物的胃炎、消化性潰瘍、胃惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到致病作用,也可能與腸道、膽道、肝臟的炎癥性疾病和一些腫瘤的發(fā)生相關(guān)。已有報(bào)道實(shí)驗(yàn)用嚙齒類動(dòng)物普遍存在螺桿菌自然感染[2,3]。
在構(gòu)建腫瘤模型和毒理實(shí)驗(yàn)研究中,實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠模型無意中感染螺桿菌將會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程,對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性產(chǎn)生潛在干擾。在美國和歐洲,大鼠、小鼠群中螺桿菌有較高的流行率[3]。美國、日本、歐洲等發(fā)達(dá)國家,以及國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物理事會(huì)早已將其列為嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原微生物。由于缺乏模式菌株和有效的檢測方法,我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量國家標(biāo)準(zhǔn)至今尚未將其列入。這嚴(yán)重妨礙了我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物事業(yè)的對外交流。因此,開展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物螺桿菌的監(jiān)測與控制,是保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的重要前提。
本研究分別應(yīng)用PCR和ELISA方法對上海及周邊地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠和實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行螺桿菌檢測,并對各自的陽性檢測率進(jìn)行比較。旨在填補(bǔ)我國實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠螺桿菌流行病學(xué)資料調(diào)查空白,分析評估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)質(zhì)量,進(jìn)一步補(bǔ)充和完善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制體系,為我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級及監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考和依據(jù)。
1.1 動(dòng)物來源
所有檢測的實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠來自上海、江蘇、浙江地區(qū)不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位,級別有清潔級和SPF級。
1.2 主要試劑
細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司;PCR所用試劑:Taq酶、dNTP、PCR buffer,DNA Marker等購自寶生物工程(大連)有限公司;大鼠、小鼠螺桿菌抗體 I gG檢測試劑盒(血清 E LISA試劑盒)購自美國EBI公司。
1.3 樣品采集
無菌采取實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠的血液,分離血清,同時(shí)采集回盲部內(nèi)容物。血清樣品-20℃凍存;回盲部內(nèi)容物-80℃凍存,備用。
1.4 大鼠、小鼠回盲部內(nèi)容物中螺桿菌核酸檢測——PCR法檢測
1.4.1 提取回盲部內(nèi)容物螺桿菌總DNA:取0.2 g回盲部內(nèi)容物,懸浮于1 mL的PBS(pH 7.4)中制成細(xì)菌懸液,然后按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書嚴(yán)格操作。
1.4.2 引物:根據(jù)螺桿菌屬特異性16SrRNA基因,合成1對引物[4]編號(hào)為:
P7:5'-CTATGACGGGTATCCGGC-3'
P8:5'-ATTCCACCTACCTCTCCCA-3'
引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
1.4.3 反應(yīng)體系:20μL體系內(nèi)含2μL 10×PCR buffer,1.6μL dNTP(each 2.5 mmol/L),引物P7、P8(10 pmol/L)各1μL,0.3μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL),3μL DNA模板,11.1μL滅菌雙蒸水。
1.4.4 反應(yīng)條件:擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。目的產(chǎn)物大小為374 bp。
1.4.5 PCR產(chǎn)物測序:隨機(jī)抽取陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收純化后送至上海英駿生物有限公司測序。
1.5 大鼠、小鼠血清抗螺桿菌 IgG抗體檢測(ELISA法)
具體操作和結(jié)果判定均嚴(yán)格按美國EBI公司試劑盒說明書操作。
2.1 大鼠、小鼠回盲部內(nèi)容物中螺桿菌抗原PCR擴(kuò)增結(jié)果
共檢測小鼠352只,其中清潔級101只,SPF級251只;共檢測大鼠101只,其中清潔級69只,SPF級32只。其詳細(xì)結(jié)果見表1。隨機(jī)抽取陽性樣本測序,結(jié)果登錄NCBI中進(jìn)行BLAST比對,與螺桿菌菌屬16SrRNA序列的同源性均在98%~100%之間,部分樣品PCR檢測結(jié)果見圖1。
2.2 大鼠、小鼠血清抗螺桿菌抗體ELISA檢測結(jié)果
應(yīng)用ELISA法共檢測小鼠88只,其中清潔級26只,SPF級62只;共檢測大鼠165只,其中清潔級84只,SPF級81只。其詳細(xì)結(jié)果見表2。
表1 不同級別大鼠、小鼠糞便中螺桿菌抗原陽性率分析Tab.1 The positive rates of Helicobacter spp.antigen in the feces from different grade rats and mice
圖1 部分樣品PCR檢測結(jié)果注:泳道1,2,4-13,15,17-21:被檢陽性樣品;泳道3,14,16:被檢陰性樣品;泳道22:陰性對照;泳道23:陽性對照;M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000Fig.1 The Results of some samples detected by PCRNote:1,2,4-13,15,17-21.The clinical positive samples;3,14,16.The clinical negative samples; 22.Negative control;23.Positive control;M.DNA marker DL2000.
表2 不同級別大鼠、小鼠血清抗螺桿菌抗體陽性率分析Tab.2 The positive rates of serum Helicobacter spp. antibody in different grade rats and mice
2.3 大鼠、小鼠螺桿菌PCR和ELISA的陽性檢測率比較
對88只小鼠,101只大鼠分別同時(shí)進(jìn)行PCR和ELISA的檢測,結(jié)果88只小鼠PCR陽性檢測率為72.7%(64/88),ELISA陽性檢測率為15.9%(14/ 88);101只大鼠PCR陽性檢測率為70.3%(71/ 101),ELISA陽性檢測率為49.5%(50/101)。
嚙齒類螺桿菌是革蘭氏陰性,螺桿狀,微需氧菌,培養(yǎng)條件苛刻,該菌呈潛伏性感染。國外已有大量報(bào)道大鼠、小鼠種群感染螺桿菌的比例呈增長趨勢[5],雖然螺桿菌感染可能會(huì)導(dǎo)致臨床疾病,但由于螺桿菌所產(chǎn)生的病理現(xiàn)象是宿主依賴型的,在臨床上很少被察覺,因此常發(fā)生實(shí)驗(yàn)人員不知道實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠已感染螺桿菌的情況。螺桿菌感染的影響不僅局限于胃腸系統(tǒng),也可能對繁殖、胃腸器官及其它器官如乳腺的腫瘤發(fā)展、疫苗免疫應(yīng)答以及其它方面產(chǎn)生影響。已有大量數(shù)據(jù)顯示,大鼠和小鼠模型無意中感染螺桿菌將會(huì)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性產(chǎn)生潛在干擾。因此,研究機(jī)構(gòu)應(yīng)定期檢查實(shí)驗(yàn)大鼠和小鼠是否感染螺桿菌并將這些病原體清除[5,6]。目前,實(shí)驗(yàn)室嚙齒類螺桿菌檢測方法主要是細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)、組織病理學(xué)、生化鑒定或電鏡觀察早期螺桿菌感染情況、免疫學(xué)方法(如ELISA)檢測感染后期的特異抗體以及分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的生化鑒定方法比較簡單,但操作繁瑣,檢測周期一般為1~2周,即使應(yīng)用商業(yè)化的快速鑒定試條也需要5~6 d。PCR方法和免疫學(xué)方法相對簡單。
本研究通過檢測大鼠和小鼠回盲部內(nèi)容物中螺桿菌抗原和血清中抗螺桿菌抗體,對大鼠和小鼠中螺桿菌攜帶率進(jìn)行了分析和評價(jià)。PCR方法檢測結(jié)果顯示,大鼠螺桿菌平均陽性率高于小鼠平均陽性率;小鼠中清潔級陽性率高于SPF級;大鼠中SPF級陽性率略高于清潔級。血清中抗螺桿菌抗體ELISA檢測結(jié)果也顯示,大鼠螺桿菌平均陽性率高于小鼠平均陽性率。清潔級大鼠和小鼠血清中抗螺桿菌抗體陽性率皆高于SPF級。國外有報(bào)道螺桿菌在實(shí)驗(yàn)小鼠上有較高的攜帶率,SPF級實(shí)驗(yàn)小鼠中腸肝科螺桿菌的檢出率達(dá)到87.5%,并且動(dòng)物之間交叉感染率達(dá)到100%[7]。此次我們調(diào)查結(jié)果顯示上海及周邊地區(qū)大鼠的螺桿菌攜帶率高于小鼠,可提示這些地區(qū)今后要進(jìn)一步加大對大鼠螺桿菌的定時(shí)監(jiān)測與飼養(yǎng)管理力度,同時(shí)也為我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物螺桿菌等級標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了一定參考和依據(jù)。
比較兩種方法的陽性檢出率結(jié)果可以看出PCR法的陽性檢出率要高于ELISA法,這與國內(nèi)外的研究均相符[8,9]。螺桿菌是經(jīng)糞口途徑傳播,長期存在于動(dòng)物腸道及糞便中,先天的體液及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)不能清除螺桿菌感染[10]。但應(yīng)注意到糞便和腸道中含有一些PCR反應(yīng)的抑制物,提高模板DNA的純度可直接影響PCR的敏感性。PCR檢驗(yàn)是以檢測病原基因?yàn)槟繕?biāo),屬“病因”診斷,因而針對性強(qiáng),對在體外難培養(yǎng)的螺桿菌,此方法特別有效,適合于進(jìn)行螺桿菌流行病學(xué)調(diào)查。ELISA方法的特異性和敏感性較好,血清學(xué)方法具有無創(chuàng)傷和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),但由于抗體的持續(xù)存在和產(chǎn)生時(shí)間,使血清學(xué)存在一定的假陽性和假陰性。在本次研究中就發(fā)現(xiàn)PCR法檢測均陰性的30只大鼠和24只小鼠中ELISA法分別檢出了15只陽性大鼠和2只陽性小鼠,ELISA法檢測均陰性的51只大鼠和74只小鼠中PCR法分別檢出了36只陽性大鼠和52只陽性小鼠。國外的相關(guān)研究也都表明血清學(xué)不太適合嚙齒類螺桿菌根除判斷,可用作螺桿菌感染后期的初篩,PCR法可用于大鼠和小鼠感染螺桿菌最終診斷結(jié)果的判定。目前,PCR方法是最快最敏感的檢測螺桿菌的方法[9]。
綜上所述,不同檢測方法的調(diào)查結(jié)果皆表明,上海及周邊地區(qū)大鼠螺桿菌的攜帶率高于小鼠,大鼠和小鼠中存在著不同程度的螺桿菌感染,這也與張麗芳、Goto等人的文獻(xiàn)報(bào)道相符[7,11,12]。兩種方法陽性檢出率比較結(jié)果表明回盲部內(nèi)容物PCR法較血清抗螺桿菌抗體ELISA檢測法更為敏感。因此,應(yīng)用PCR檢測大鼠和小鼠中螺桿菌DNA是可行的,且具有較高的特異性。本次研究也表明,在加強(qiáng)PCR引物、試劑和操作的標(biāo)準(zhǔn)化前提下,PCR檢測方法可以用于大鼠和小鼠螺桿菌的初步調(diào)查和流行病學(xué)監(jiān)測,從而為我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物螺桿菌的感染狀況提供有用的流行病學(xué)數(shù)據(jù),這也有助于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群中螺桿菌隱性感染的及時(shí)監(jiān)測,從而進(jìn)一步降低或減少對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的潛在干擾。
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