兩種方法對上海及周邊地區(qū)實(shí)驗(yàn)大小鼠螺桿菌攜帶情況的調(diào)查

丁 聰，馮 潔，謝建云，高 誠，3，胡建華

（1.揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，揚(yáng)州 225009；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上海 201203； 3.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所，上海 200032）

螺桿菌菌屬（Helicobacter spp.）是一組最初從人類和其他哺乳動(dòng)物胃中分離出來的革蘭氏陰性、微需氧、螺旋彎曲狀細(xì)菌，其中具有代表性的是H.pylori。根據(jù)它們喜好的定居部位，可被分為胃螺桿菌和腸肝螺桿菌（enterohepatic helicobacter species，EHS）［1］。自1992年Lee等人發(fā)現(xiàn)了鼠型螺桿菌以來，已從嚙齒類動(dòng)物腸道中分離出了大量的螺桿菌屬新菌株。目前，已有20余種寄生于某些動(dòng)物和人類胃腸道且有致病性的螺桿菌被正式命名。對嚙齒類而言，有肝型（H.hepacticus）、鼠型（H.muridarum）和膽型（H.bilis）。嚙齒類螺桿菌以隱性感染的形式廣泛存在于實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠中［1］，被感染動(dòng)物大多數(shù)以慢性、潛伏性感染為主，無明顯癥狀?，F(xiàn)已有研究顯示這類細(xì)菌不僅在人或動(dòng)物的胃炎、消化性潰瘍、胃惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到致病作用，也可能與腸道、膽道、肝臟的炎癥性疾病和一些腫瘤的發(fā)生相關(guān)。已有報(bào)道實(shí)驗(yàn)用嚙齒類動(dòng)物普遍存在螺桿菌自然感染［2，3］。

在構(gòu)建腫瘤模型和毒理實(shí)驗(yàn)研究中，實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠模型無意中感染螺桿菌將會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性產(chǎn)生潛在干擾。在美國和歐洲，大鼠、小鼠群中螺桿菌有較高的流行率［3］。美國、日本、歐洲等發(fā)達(dá)國家，以及國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物理事會(huì)早已將其列為嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原微生物。由于缺乏模式菌株和有效的檢測方法，我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量國家標(biāo)準(zhǔn)至今尚未將其列入。這嚴(yán)重妨礙了我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物事業(yè)的對外交流。因此，開展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物螺桿菌的監(jiān)測與控制，是保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的重要前提。

本研究分別應(yīng)用PCR和ELISA方法對上海及周邊地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠和實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行螺桿菌檢測，并對各自的陽性檢測率進(jìn)行比較。旨在填補(bǔ)我國實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠螺桿菌流行病學(xué)資料調(diào)查空白，分析評估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)質(zhì)量，進(jìn)一步補(bǔ)充和完善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制體系，為我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級及監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來源

所有檢測的實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠來自上海、江蘇、浙江地區(qū)不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位，級別有清潔級和SPF級。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司；PCR所用試劑：Taq酶、dNTP、PCR buffer，DNA Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司；大鼠、小鼠螺桿菌抗體 I gG檢測試劑盒（血清 E LISA試劑盒）購自美國EBI公司。

1.3 樣品采集

無菌采取實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠的血液，分離血清，同時(shí)采集回盲部內(nèi)容物。血清樣品-20℃凍存；回盲部內(nèi)容物-80℃凍存，備用。

1.4 大鼠、小鼠回盲部內(nèi)容物中螺桿菌核酸檢測——PCR法檢測

1.4.1 提取回盲部內(nèi)容物螺桿菌總DNA：取0.2 g回盲部內(nèi)容物，懸浮于1 mL的PBS（pH 7.4）中制成細(xì)菌懸液，然后按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書嚴(yán)格操作。

1.4.2 引物：根據(jù)螺桿菌屬特異性16SrRNA基因，合成1對引物［4］編號(hào)為：

P7：5＇-CTATGACGGGTATCCGGC-3＇

P8：5＇-ATTCCACCTACCTCTCCCA-3＇

引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4.3 反應(yīng)體系：20μL體系內(nèi)含2μL 10×PCR buffer，1.6μL dNTP（each 2.5 mmol/L），引物P7、P8（10 pmol/L）各1μL，0.3μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），3μL DNA模板，11.1μL滅菌雙蒸水。

1.4.4 反應(yīng)條件：擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。目的產(chǎn)物大小為374 bp。

1.4.5 PCR產(chǎn)物測序：隨機(jī)抽取陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收純化后送至上海英駿生物有限公司測序。

1.5 大鼠、小鼠血清抗螺桿菌 IgG抗體檢測（ELISA法）

具體操作和結(jié)果判定均嚴(yán)格按美國EBI公司試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 大鼠、小鼠回盲部內(nèi)容物中螺桿菌抗原PCR擴(kuò)增結(jié)果

共檢測小鼠352只，其中清潔級101只，SPF級251只；共檢測大鼠101只，其中清潔級69只，SPF級32只。其詳細(xì)結(jié)果見表1。隨機(jī)抽取陽性樣本測序，結(jié)果登錄NCBI中進(jìn)行BLAST比對，與螺桿菌菌屬16SrRNA序列的同源性均在98％～100％之間，部分樣品PCR檢測結(jié)果見圖1。

2.2 大鼠、小鼠血清抗螺桿菌抗體ELISA檢測結(jié)果

應(yīng)用ELISA法共檢測小鼠88只，其中清潔級26只，SPF級62只；共檢測大鼠165只，其中清潔級84只，SPF級81只。其詳細(xì)結(jié)果見表2。

表1 不同級別大鼠、小鼠糞便中螺桿菌抗原陽性率分析Tab.1 The positive rates of Helicobacter spp.antigen in the feces from different grade rats and mice

圖1 部分樣品PCR檢測結(jié)果注：泳道1，2，4-13，15，17-21：被檢陽性樣品；泳道3，14，16：被檢陰性樣品；泳道22：陰性對照；泳道23：陽性對照；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000Fig.1 The Results of some samples detected by PCRNote：1，2，4-13，15，17-21.The clinical positive samples；3，14，16.The clinical negative samples； 22.Negative control；23.Positive control；M.DNA marker DL2000.

表2 不同級別大鼠、小鼠血清抗螺桿菌抗體陽性率分析Tab.2 The positive rates of serum Helicobacter spp. antibody in different grade rats and mice

2.3 大鼠、小鼠螺桿菌PCR和ELISA的陽性檢測率比較

對88只小鼠，101只大鼠分別同時(shí)進(jìn)行PCR和ELISA的檢測，結(jié)果88只小鼠PCR陽性檢測率為72.7％（64/88），ELISA陽性檢測率為15.9％（14/ 88）；101只大鼠PCR陽性檢測率為70.3％（71/ 101），ELISA陽性檢測率為49.5％（50/101）。

3 討論

嚙齒類螺桿菌是革蘭氏陰性，螺桿狀，微需氧菌，培養(yǎng)條件苛刻，該菌呈潛伏性感染。國外已有大量報(bào)道大鼠、小鼠種群感染螺桿菌的比例呈增長趨勢［5］，雖然螺桿菌感染可能會(huì)導(dǎo)致臨床疾病，但由于螺桿菌所產(chǎn)生的病理現(xiàn)象是宿主依賴型的，在臨床上很少被察覺，因此常發(fā)生實(shí)驗(yàn)人員不知道實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠已感染螺桿菌的情況。螺桿菌感染的影響不僅局限于胃腸系統(tǒng)，也可能對繁殖、胃腸器官及其它器官如乳腺的腫瘤發(fā)展、疫苗免疫應(yīng)答以及其它方面產(chǎn)生影響。已有大量數(shù)據(jù)顯示，大鼠和小鼠模型無意中感染螺桿菌將會(huì)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性產(chǎn)生潛在干擾。因此，研究機(jī)構(gòu)應(yīng)定期檢查實(shí)驗(yàn)大鼠和小鼠是否感染螺桿菌并將這些病原體清除［5，6］。目前，實(shí)驗(yàn)室嚙齒類螺桿菌檢測方法主要是細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)、組織病理學(xué)、生化鑒定或電鏡觀察早期螺桿菌感染情況、免疫學(xué)方法（如ELISA）檢測感染后期的特異抗體以及分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的生化鑒定方法比較簡單，但操作繁瑣，檢測周期一般為1～2周，即使應(yīng)用商業(yè)化的快速鑒定試條也需要5～6 d。PCR方法和免疫學(xué)方法相對簡單。

本研究通過檢測大鼠和小鼠回盲部內(nèi)容物中螺桿菌抗原和血清中抗螺桿菌抗體，對大鼠和小鼠中螺桿菌攜帶率進(jìn)行了分析和評價(jià)。PCR方法檢測結(jié)果顯示，大鼠螺桿菌平均陽性率高于小鼠平均陽性率；小鼠中清潔級陽性率高于SPF級；大鼠中SPF級陽性率略高于清潔級。血清中抗螺桿菌抗體ELISA檢測結(jié)果也顯示，大鼠螺桿菌平均陽性率高于小鼠平均陽性率。清潔級大鼠和小鼠血清中抗螺桿菌抗體陽性率皆高于SPF級。國外有報(bào)道螺桿菌在實(shí)驗(yàn)小鼠上有較高的攜帶率，SPF級實(shí)驗(yàn)小鼠中腸肝科螺桿菌的檢出率達(dá)到87.5％，并且動(dòng)物之間交叉感染率達(dá)到100％［7］。此次我們調(diào)查結(jié)果顯示上海及周邊地區(qū)大鼠的螺桿菌攜帶率高于小鼠，可提示這些地區(qū)今后要進(jìn)一步加大對大鼠螺桿菌的定時(shí)監(jiān)測與飼養(yǎng)管理力度，同時(shí)也為我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物螺桿菌等級標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了一定參考和依據(jù)。

比較兩種方法的陽性檢出率結(jié)果可以看出PCR法的陽性檢出率要高于ELISA法，這與國內(nèi)外的研究均相符［8，9］。螺桿菌是經(jīng)糞口途徑傳播，長期存在于動(dòng)物腸道及糞便中，先天的體液及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)不能清除螺桿菌感染［10］。但應(yīng)注意到糞便和腸道中含有一些PCR反應(yīng)的抑制物，提高模板DNA的純度可直接影響PCR的敏感性。PCR檢驗(yàn)是以檢測病原基因?yàn)槟繕?biāo)，屬“病因”診斷，因而針對性強(qiáng)，對在體外難培養(yǎng)的螺桿菌，此方法特別有效，適合于進(jìn)行螺桿菌流行病學(xué)調(diào)查。ELISA方法的特異性和敏感性較好，血清學(xué)方法具有無創(chuàng)傷和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，但由于抗體的持續(xù)存在和產(chǎn)生時(shí)間，使血清學(xué)存在一定的假陽性和假陰性。在本次研究中就發(fā)現(xiàn)PCR法檢測均陰性的30只大鼠和24只小鼠中ELISA法分別檢出了15只陽性大鼠和2只陽性小鼠，ELISA法檢測均陰性的51只大鼠和74只小鼠中PCR法分別檢出了36只陽性大鼠和52只陽性小鼠。國外的相關(guān)研究也都表明血清學(xué)不太適合嚙齒類螺桿菌根除判斷，可用作螺桿菌感染后期的初篩，PCR法可用于大鼠和小鼠感染螺桿菌最終診斷結(jié)果的判定。目前，PCR方法是最快最敏感的檢測螺桿菌的方法［9］。

綜上所述，不同檢測方法的調(diào)查結(jié)果皆表明，上海及周邊地區(qū)大鼠螺桿菌的攜帶率高于小鼠，大鼠和小鼠中存在著不同程度的螺桿菌感染，這也與張麗芳、Goto等人的文獻(xiàn)報(bào)道相符［7，11，12］。兩種方法陽性檢出率比較結(jié)果表明回盲部內(nèi)容物PCR法較血清抗螺桿菌抗體ELISA檢測法更為敏感。因此，應(yīng)用PCR檢測大鼠和小鼠中螺桿菌DNA是可行的，且具有較高的特異性。本次研究也表明，在加強(qiáng)PCR引物、試劑和操作的標(biāo)準(zhǔn)化前提下，PCR檢測方法可以用于大鼠和小鼠螺桿菌的初步調(diào)查和流行病學(xué)監(jiān)測，從而為我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物螺桿菌的感染狀況提供有用的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，這也有助于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群中螺桿菌隱性感染的及時(shí)監(jiān)測，從而進(jìn)一步降低或減少對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的潛在干擾。

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