云南獼猴mtDNA控制區(qū)全序列測(cè)定

禹文海，黃 芬，楊鳳梅，魯帥堯，趙 遠(yuǎn)，沈 冬，王俊斌，陳麗雄，和占龍

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650118； 2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650224）

線粒體DNA（m tDNA）是細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)，呈共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，能夠獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，其具有母系方式遺傳、堿基變異大、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)。其中，線粒體DNA控制區(qū)的進(jìn)化速度是線粒體DNA其它區(qū)域的3～5倍，在生物遺傳進(jìn)化和種群遺傳變異程度的研究中應(yīng)用廣泛［1-5］。獼猴又稱恒河猴、廣西猴、黃猴，為靈長(zhǎng)目猴科獼猴屬的一個(gè)種。云南位于中國(guó)的西南方，獼猴資源十分豐富，在北部、西北部、中部、南部和東北部等均有分布［6］。本研究以云南獼猴作為研究對(duì)象，測(cè)定線粒體控制區(qū)全序列，為獼猴的進(jìn)化分析及開展獼猴遺傳資源保護(hù)和合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和DNA提取

實(shí)驗(yàn)采集獼猴全血共7份（鎮(zhèn)康縣1份、景東縣1份、鎮(zhèn)沅縣1份、保山市1份、鄧川縣1份、牟定縣1份、寧蒗縣1份），來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所全國(guó)醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：（滇）SCXK2010—0006。靜脈抽取全血2 m L，EDTA抗凝。采用Axygen DNA提取試劑盒提取基因組DNA，詳細(xì)操作步驟見說(shuō)明書。

1.2 PCR擴(kuò)增與目的片段測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)選取引物對(duì)［7，8］，上游引物F（5＇-CCTTACCTGAATTGGAAGCGAACC-3＇）和下游引物R（5＇-GGCCAGGACCAAGCCTATTT-3＇），由生工生物工程（上海）有限公司合成。在PCR儀（Bio-Rad C1000）中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體積為25μL，引物F和R各（20μmol/L）0.5μL，模板DNA 2μL，2× PCR Master M ix 12.5μL，雙蒸H2O 9.5μL。反應(yīng)條件為95℃6 min，然后94℃1 m in，66℃45 s，72℃1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，參照DNA marker DL2000出現(xiàn)1 450 bp左右條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化測(cè)序，測(cè)序由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

每個(gè)個(gè)體測(cè)得的正反鏈序列用DNAStar軟件進(jìn)行分析拼接，用Clustalx1.8軟件進(jìn)行序列比對(duì)并輔以人工校對(duì)，用DNAStar軟件對(duì)序列間同源性進(jìn)行分析，用MEGA4.0軟件分析序列的堿基組成、轉(zhuǎn)換和顛換。以來(lái)源于美國(guó)威斯康星州國(guó)家靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中心（WRPRC）的獼猴（GenBank No.AY612638）為外群，分別用鄰接法（neighbor-joining，NJ）和最小進(jìn)化法（minimum-evolution，ME）構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 序列測(cè)定與鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到產(chǎn)物大小約為1 450 bp，去除線粒體DNA控制區(qū)兩側(cè)的序列后，測(cè)得云南獼猴線粒體控制區(qū)全序列的長(zhǎng)度為1 084～1 089 bp，利用BLAST和GenBank中的獼猴線粒體序列進(jìn)行比較，同源性達(dá)到91.5％以上，說(shuō)明該序列為獼猴m tDNA控制區(qū)。本研究測(cè)得的云南獼猴線粒體DNA控制區(qū)全序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，GenBank No.為JF746819（保山）、JF746820（鄧川）、JF746824（景東）、牟定（JF834919）、JF746839（寧蒗）、JF746823（鎮(zhèn)康）和JF746817（鎮(zhèn)沅）。

2.2 序列堿基組成、遺傳變異及同源性分析

線粒體控制區(qū)核苷酸序列堿基組成見表1，不同地區(qū)獼猴線粒體DNA控制區(qū)G+C的含量（42.9％～43.8％）低于A+T的含量（56.2％～57.1％），A堿基含量為29.6％～30.2％，C堿基含量為30.4％～31.4％，T堿基含量為26.5％～27.4％，G堿基含量為12.2％～12.5％。序列遺傳變異包括轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失4種形式，經(jīng)MEGA4.0軟件分析可知序列中的轉(zhuǎn)換明顯比顛換多，其中T-C轉(zhuǎn)換多于A-G，A-C和A-T顛換多于CG和T-G，轉(zhuǎn)換/顛換比值平均為26.1。

表1 不同地區(qū)獼猴線粒體DNA控制區(qū)核苷酸堿基組成比較Tab.1 Comparison of nucleotides composition in the m tDNA control region of Macaca mulatta from different areas

不同地區(qū)獼猴線粒體控制區(qū)全序列間差異及同源性見圖1。

圖1 不同地區(qū)獼猴線粒體DNA控制區(qū)全序列間同源性分析Fig.1 Homology of the m tDNA control region ofMacaca mulatta from different areas

云南不同地區(qū)獼猴的同源性為93.2％～99.5％，具有較高的同源性，同源性最高的是鎮(zhèn)沅和景東獼猴，其次是鄧川和寧蒗獼猴，同源性最低的是鄧川和牟定獼猴。與GenBank中參考序列（AY612638）同源性為91.5％～92.4％之間，其中，與鄧川獼猴同源性最高（92.4％），與牟定獼猴同源性最低（91.5％）。

2.3 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

以美國(guó)威斯康星州國(guó)家靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中心的獼猴為外群構(gòu)建NJ樹（圖2-A）和ME樹（圖2-B），各分支上的數(shù)值為1000次自舉（Bootstrap）分析得到的支持率。從圖3中可以看出NJ樹和ME樹具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，兩者均表明所分析的獼猴分為兩大分支，來(lái)源于美國(guó)的獼猴單獨(dú)為一支，而云南獼猴聚為一支。云南獼猴分為兩個(gè)平行的姐妹分支，保山和牟定獼猴為一支；景東、鎮(zhèn)沅、鄧川、寧蒗和鎮(zhèn)康獼猴聚為另一支。其中，景東和鎮(zhèn)沅以及鄧川和寧蒗獼猴遺傳關(guān)系最近。

圖2 基于線粒體DNA控制區(qū)構(gòu)建的NJ（A）和ME（B）系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic trees constructed using NJ（A）and ME（B）methodsbased on the comp lete sequences ofm tDNA control region

3 討論

云南獼猴線粒體DNA控制區(qū)全長(zhǎng)為1 084～1 089 bp，A、T、G和C四種堿基平均含量分別為29.9％、26.9％、12.3％和30.9％，序列表現(xiàn)出了很強(qiáng)的反G偏倚（即G的含量明顯低于其它3種堿基的含量），這與脊椎動(dòng)物線粒體DNA的G堿基極低現(xiàn)象一致［9-12］。A+T堿基平均含量（56.8％）高于G+C堿基平均含量（43.2％），與其它哺乳動(dòng)物A、T含量高和G、C含量低的特點(diǎn)相似。序列變異包括了轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失四種形式，其中轉(zhuǎn)換最為常見，轉(zhuǎn)換與顛換的比值為26.1，明顯大于轉(zhuǎn)換與顛換比的臨界值2.0［13］，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏愛(ài)性，與其他哺乳動(dòng)物線粒體DNA序列的研究結(jié)果是一致的［14，15］，同時(shí)也說(shuō)明云南獼猴線粒體DNA控制區(qū)序列突變未達(dá)到飽和狀態(tài)。

我們采用鄰接法（NJ）和最小進(jìn)化法（ME）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以來(lái)源于美國(guó)威斯康星州國(guó)家靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中心的獼猴為外群，分析不同地區(qū)獼猴的遺傳進(jìn)化關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示云南獼猴聚為一支，而來(lái)源于美國(guó)的獼猴單獨(dú)聚為一支。就云南獼猴而言存在兩個(gè)姐妹分支，來(lái)自不同地區(qū)的獼猴大多按照其來(lái)源地分別相對(duì)聚在一起，表現(xiàn)出與地理位置一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。目前未見報(bào)道國(guó)內(nèi)其它地區(qū)獼猴線粒體DNA控制區(qū)全序列的測(cè)定和提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，少數(shù)研究報(bào)道只是測(cè)定了其中的部分序列，因此本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有與國(guó)內(nèi)其它地區(qū)獼猴群體進(jìn)行比較研究。

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