SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突變促進(jìn)組織白細(xì)胞浸潤(rùn)和器官損傷

胡中倩，汪心怡，儲(chǔ)著朗，鄭賢芳，陳 吉，余科科，李菲菲，瞿成奎，汪思應(yīng)

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，合肥 230032；2.美國(guó)凱斯西儲(chǔ)大學(xué)，克里夫蘭 44106）

SHP-2屬于蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPase）家族成員之一，作為細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及其他胞外刺激因素的下游信號(hào)分子，表達(dá)于機(jī)體的各種組織和細(xì)胞中，與許多重要的細(xì)胞生命活動(dòng)（如細(xì)胞增殖、分化、移動(dòng)、死亡的調(diào)控）密切相關(guān)［1，2］。近年來(lái)，SHP-2突變?cè)诎籽?、?shí)體瘤和努南綜合征中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)［3］，是最早被定義為癌基因的酪氨酸磷酸酶。SHP-2突變位點(diǎn)主要位于N端SH2結(jié)構(gòu)域，其中最常見(jiàn)的是E76K和D61G/Y突變，這些激活突變使得N-SH2與PTP結(jié)構(gòu)域的自身結(jié)合部分或完全解離，導(dǎo)致SHP-2酪氨酸磷酸酶的活性不同程度增強(qiáng)，故稱激活突變（gain-offunction mutation）。SHP-2激活突變可能與腫瘤尤其是白血病細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，如高增殖敏感性、耐藥、易侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。臨床也發(fā)現(xiàn)部分青少年粒細(xì)胞性白血病（JMML）患兒（35％患者體內(nèi)存在SHP-2激活突變）發(fā)病早、進(jìn)展快，多數(shù)患者因白細(xì)胞包括白血病細(xì)胞大量浸潤(rùn)導(dǎo)致多器官衰竭而早期死亡［4］。

前期研究［5-7］從細(xì)胞和分子水平證實(shí)，SHP-2D61G/+激活突變可能通過(guò)增強(qiáng)的NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)白細(xì)胞黏附、侵襲。本研究以SHP-2D61G/+激活突變敲入的模型小鼠為研究對(duì)象，進(jìn)一步從整體水平觀察SHP-2激活突變對(duì)組織白細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子分泌和多器官損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；放射免疫試劑盒由中國(guó)原子能科學(xué)研究院提供，儀器為FJ-2008型γ免疫計(jì)數(shù)器；光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)購(gòu)于日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SHP-2D61G/+激活突變小鼠由美國(guó)Case Western Reserve大學(xué)瞿成奎教授提供，模型小鼠表達(dá)生理水平的SHP-2D61G蛋白，但磷酸酶活性卻升高2～5倍。野生型小鼠采用C57BL/6小鼠，雌雄各半，16周齡，體重25±0.2 g，SPF級(jí)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（皖）2009-0001］）。

1.3 小鼠白細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌采取小鼠血1 mL，嚴(yán)格按照白細(xì)胞分離液說(shuō)明書操作。細(xì)胞培養(yǎng)用含10％滅活新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（含105U/L青霉素，105U/L鏈霉素），在37℃、5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)。

1.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2和TNF-α

設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔（每孔加樣100μL），加入detection antibody工作液50μL，室溫孵育2 h后用wash buffer反復(fù)洗滌5次；然后加入streptavidin-HRP工作液100μL，室溫反應(yīng)30 min后充分洗滌；依次加入color reagent A和color reagent B各50μL，室溫避光顯色30 m in，之后加入stop solution 50μL終止反應(yīng)；用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量A值。根據(jù)樣品的A450值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即可得到樣品中待檢物質(zhì)的實(shí)際濃度。

1.5 血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和cTnI水平的檢測(cè)

16周齡小鼠，取內(nèi)眥靜脈血，分離血清，按試劑盒說(shuō)明采用放射免疫法檢測(cè)血清中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和肌鈣蛋白I。

1.6 心、肺、脾組織的病理觀察

常規(guī)石蠟切片（厚度6～7μm），采用HE染色，依次進(jìn)行脫蠟（二甲苯I 10 min，二甲苯II 5 min）、水化（100％酒精I(xiàn) 5 min，100％酒精I(xiàn)I 5 min，95％酒精I(xiàn) 5 m in，95％酒精I(xiàn)I 5 m in，85％酒精3 min，75％酒精2 m in，蒸餾水沖洗1 min）、染色（蘇木精染色5 min，自來(lái)水洗，鹽酸酒精分化15 s，自來(lái)水洗15 m in，蒸餾水洗2 m in，75％酒精2 m in，85％酒精2 m in，0.5％伊紅染色1 min，95％酒精I(xiàn) 5 m in，95％酒精I(xiàn)I 5 min，100％酒精I(xiàn) 5 min，100％酒精I(xiàn)I 5 min，二甲苯I 5 min，二甲苯II 5min）。中性樹(shù)膠封片后，光鏡下觀察組織病理變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SHP-2D61G/+激活突變對(duì)小鼠組織器官白細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

與SHP-2+/+野生型小鼠相比，SHP-2D61G/+激活突變小鼠肺、脾組織中可見(jiàn)大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，組織損傷并有淤血、出血表現(xiàn)；心肌組織主要表現(xiàn)為肥大，但光鏡下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯白細(xì)胞浸潤(rùn)及損傷表現(xiàn)（圖1見(jiàn)彩插3）。

2.2 SHP-2D61G/+激活突變對(duì)小鼠白細(xì)胞分泌炎癥因子的影響

白細(xì)胞浸潤(rùn)組織后可以分泌細(xì)胞因子包括炎癥因子、趨化因子等，本研究首先觀察體外白細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子的水平。與野生型對(duì)照組相比，SHP-2D61G/+激活突變小鼠白細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2及TNF-α濃度均顯著增加（P＜0.01），說(shuō)明SHP-2激活突變使白細(xì)胞分泌炎癥因子水平明顯提高（表1）。

表1 SHP-2D61G/+激活突變對(duì)白細(xì)胞分泌炎癥因子的影響（n=8）Tab.1 Effect of SHP-2D61G/+mutations on leukocyte secretion of inflammatory factors in the mice（n=8）

2.3 SHP-2D61G/+激活突變對(duì)小鼠血清炎癥因子水平的影響

本研究進(jìn)一步在體觀察了血清中上述炎癥因子的水平。與野生型小鼠相比，SHP-2D61G/+激活突變小鼠血清中IL-2和TNF-α濃度均顯著增高（P＜0.01）（表2）。

表2 SHP-2D61G/+激活突變對(duì)血清炎癥因子水平的影響（n=8）Tab.2 Effect of SHP-2D61G/+mutations on serum levels of inflammatory factors in the m ice（n=8）

2.4 SHP-2D61G/+激活突變對(duì)小鼠血清ALT及cTnI水平的影響

血清ALT及cTnI水平分別是反應(yīng)肝臟和心臟組織損傷的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用放射免疫法檢測(cè)野生型和SHP-2D61G/+激活突變小鼠血清中ALT及cTn I水平。SHP-2突變小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶明顯高于對(duì)照組（圖2）。盡管組織學(xué)檢測(cè)在光鏡下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)心肌明顯損傷，但反應(yīng)心肌損傷敏感指標(biāo)之一的肌鈣蛋白I水平在突變小鼠血清中明顯升高（圖3），提示心肌亦有損傷。事實(shí)上SHP-2激活突變導(dǎo)致奴南氏綜合征患者也出現(xiàn)心臟肥大和心肌損傷。

圖2 SHP-2D61G/+激活突變對(duì)小鼠血清ALT水平的影響（n=12）Fig.2 Effect of SHP-2D61G/+mutations on serum ALT levels in the m ice（n=12）

圖3 SHP-2D61G/+激活突變對(duì)小鼠血清cTn I水平的影響（n=12）Fig.3 Effect of SHP-2D61G/+mutations onserum cTnI level in themice（n=12）

3 討論

SHP-2是非受體依賴的酪氨酸磷酸酶，其N端SH-2結(jié)構(gòu)域是一個(gè)含有100個(gè)氨基酸殘基的基團(tuán)，與激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，通過(guò)分子內(nèi)的相互抑制，使磷酸酶維持在鈍化狀態(tài)而抑制了SHP-2磷酸酶的活性。當(dāng)SHP-2通過(guò)SH-2功能域結(jié)合到具有磷酸化的酪氨酸殘基的蛋白質(zhì)，使PTP酶激活，從而作為下游信號(hào)分子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8，9］。Neel等［10］制備了SHP-2D61G/+突變基因敲入小鼠模型，研究顯示該小鼠經(jīng)DNA損傷性藥物處理后，其白血病發(fā)病明顯高于正常鼠，說(shuō)明SHP-2D61G/+激活突變可促進(jìn)白血病發(fā)病。本研究采用已經(jīng)建立的SHP-2D61G/+基因敲入小鼠為研究對(duì)象，證實(shí)SHP-2D61G/+激活突變促進(jìn)組織白細(xì)胞嚴(yán)重浸潤(rùn)和心、肝、脾、肺等多器官損傷。

細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的失控性釋放是導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS）的重要原因。前期研究從細(xì)胞和分子水平證實(shí)，SHP-2D61G/+激活突變促進(jìn)白細(xì)胞粘附及侵襲能力。本研究不僅在離體實(shí)驗(yàn)中證實(shí)SHP-2D61G/+激活突變使白細(xì)胞分泌炎癥因子明顯增加，而且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)小鼠血清中IL-2和TNF-α水平均顯著升高；這些炎癥因子的增加會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致器官損傷。

小鼠血清cTn I和ALT水平在SHP-2D61G/+突變小鼠中明顯高于野生型小鼠。cTn I是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種高特異、高靈敏反映心肌損傷的血清標(biāo)志物，cTn I以兩種形式存在于心肌細(xì)胞中，即小部分游離于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，為可溶性；大部分以結(jié)構(gòu)蛋白形式固定于肌原纖維上，為不溶性。當(dāng)胞膜的完整性因缺血、缺氧受到破壞時(shí)，游離的cTnI可迅速透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入血流；而結(jié)合的cTn I則逐漸分解出來(lái)，成為游離的cTnI。因此，外周血中cTn I濃度增加，必然是心肌細(xì)胞損傷的結(jié)果。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死、中毒時(shí)，造成肝細(xì)胞破壞，ALT便會(huì)釋放到血液里，使血清ALT升高。通過(guò)檢測(cè)血液中ALT可以反映肝細(xì)胞有無(wú)受損［11］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)突變小鼠器官進(jìn)行病理切片、HE染色鏡檢，結(jié)果顯示SHP-2D61G/+突變小鼠脾、肺組織可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)、血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、血管內(nèi)淤血和組織損傷，心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大。當(dāng)炎癥細(xì)胞過(guò)度活化，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)相互作用通過(guò)瀑布式級(jí)聯(lián)效應(yīng)，炎癥反應(yīng)泛濫、失控；而抗炎介質(zhì)過(guò)度表達(dá)和釋放可引起免疫功能的抑制，導(dǎo)致機(jī)體失衡，最終導(dǎo)致全身組織器官的損傷而發(fā)展為多器官功能障礙綜合征和衰竭［12］。研究進(jìn)一步對(duì)此改變做了初步的分子機(jī)制探討，結(jié)果顯示SHP-2異常增高的磷酸酶活性是發(fā)生多臟器衰竭的主要原因。上述結(jié)果為臨床部分白血病患者易出現(xiàn)多器官功能衰竭的機(jī)制研究提供了一定的線索。這是否是SHP-2激活突變小鼠病情惡化的原因，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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