甲型H1N1流感病毒感染不同免疫缺陷小鼠的比較

劉 穎，鄧 巍，徐艷峰，朱 華，馬春梅，李楓棣，鮑琳琳，秦 川

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室）

流感病毒的全球流行往往導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，1918年的西班牙流感最終致使5 000萬人死亡，而2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感病毒的大流行迅速蔓延傳播至世界兩百多個國家和地區(qū)，造成數(shù)萬人死亡。流感病毒感染宿主后，針對病原體的適應(yīng)性免疫在病毒的清除中起到關(guān)鍵作用，并據(jù)此設(shè)計出多種流感疫苗應(yīng)。近來隨著對非特異性的固有免疫的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)包括NK細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和DC等在控制病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)病毒特異的適應(yīng)性免疫中都起到重要的作用。缺少T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的小鼠不能抵御病毒感染但能夠通過給予特異性抗體進(jìn)行治療，而T細(xì)胞和B細(xì)胞重排缺陷的小鼠感染后始終不能清除病毒，體重持續(xù)下降直到死亡。本研究中使用了四種不同的免疫缺陷型小鼠建立甲型H1N1流感病毒感染模型，比較了其在感染病毒后動物的存活率、體重減少情況和肺組織病變上與野生型小鼠的差異。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性4～6周C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠、SCID小鼠、NOD/LtJ小鼠、BALB/c-nu小鼠和NODSCID小鼠（各10只）（由北京華阜康提供SCXK2009-0004）。小鼠按品系分籠飼養(yǎng)，實驗前3 d安置于ABSL-3實驗室獨立送風(fēng)隔離籠具中適應(yīng)環(huán)境。

1.2 病毒感染

H1N1病毒A/California/7/2009（CA7）株，以106TCID50。各品系小鼠經(jīng)乙醚麻醉后進(jìn)行滴鼻攻毒，每只小鼠50μL，攻毒后每天觀察，分別于第4天、第7天和第14天處死小鼠取材檢測小鼠感染后的肺組織病毒載量和病理改變。實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所ABSL-3實驗室中進(jìn)行。

1.3 動物犧牲及標(biāo)本處理

斷頸處死小鼠，打開胸腔，保留肺組織：取右上肺葉于組織裂解液中用于提取組織RNA；取右中肺葉于凍存管置-80℃冰箱中備份保存；其余肺葉于10％中性甲醛溶液中固定。

1.4 肺組織總RNA提取及PCR檢測

RNeasy Mini Kit試劑盒（Qiagen，74106）提取肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI，4367659）進(jìn)行real-time PCR檢測（ABI Stepone PCR儀）。擴增程序94℃3 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，共35個循環(huán)；95℃，15 s；60℃1 min；95℃15 s。每次試驗的標(biāo)準(zhǔn)品作106copies/m L、105copies/m L、104copies/m L、103copies/m L、102copies/m L濃度梯度稀釋，陰性對照（H2O）與樣品一起提取RNA后做realtime PCR。通過讀取儀器數(shù)據(jù)得到病毒載量。所用H1N1亞型特異性引物為 SW-H1 F786 5’-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3’，SW-H1 R920 5’-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3’，目的片段大小為153 bp［1］。

1.5 病理學(xué)檢查

取小鼠肺組織，10％中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察其病理變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

小鼠的體重變化用體重百分比表示，即以小鼠當(dāng)天體重減去0 d體重的差值作分子，以0 d體重做分母，記錄為平均體重變化±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)值采用每組的平均數(shù)。各組小鼠肺組織病變面積使用單因素方差分析進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 小鼠感染后存活情況和大體觀察

各組小鼠感染H1N1病毒后逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少、消瘦、被毛逆立、弓背、反應(yīng)遲鈍等癥狀。感染H1N1病毒的6種小鼠在觀察的14 d內(nèi)，僅有野生型的C57BL/6小鼠有50％存活，BALB/c小鼠和各免疫缺陷品系的小鼠死亡率均為100％。其中，NK細(xì)胞缺陷的NOD/LtJ小鼠感染早期即開始大量死亡，至感染后第8天已經(jīng)沒有存活小鼠；T細(xì)胞缺陷的BALB/c-nu小鼠在中晚期大量死亡，至感染后第11天全部死亡；而T細(xì)胞和B細(xì)胞缺陷的SCID和T、B、NK細(xì)胞聯(lián)合缺陷的NOD-SCID小鼠分別于感染后第3天和第4天開始出現(xiàn)死亡，至感染后第13天和第12天全部死亡（圖1）。剖檢過程中可見感染小鼠肺臟有明顯的充血和水腫，肺組織表面有局部實變，其他臟器未見明顯改變。

圖1 不同品系小鼠感染H1N1流感病毒存活率Fig.1 Survival rate of differentmouse strains infected with influenza A（H1N1）virus

2.2 小鼠體重變化

C57BL/6小鼠體重下降緩慢，只（7～10）d降至最低，約為實驗前的80％～90％，而后存活小鼠體重逐漸回升；其余品系小鼠體重隨病情發(fā)展快速下降，直至死亡，其中SCID小鼠體重下降最快，10 d降至感染前體重的60％以下，BALB/c小鼠、NOD/ LtJ、BALB/c-nu和NOD-SCID小鼠體重下降較快，（7～10）d降至感染前體重的60％～70％（圖2）。

圖2 不同品系小鼠感染H1N1流感病毒后體重變化情況Fig.2 Different laboratory mouse strains exhibit variablekinetics of weight loss after influenza A（H1N1）virus infection

2.3 小鼠肺組織病毒載量檢測結(jié)果

攻毒后4 d和7 d處死小鼠取肺組織RT-PCR檢測流感病毒的表達(dá)量（表1），各組小鼠均染毒。攻毒后4 d C57BL/6小鼠病毒載量較小，其余各品系小鼠病毒載量較大，將各組小鼠病毒拷貝數(shù)取對數(shù)后進(jìn)行方差分析，各品系小鼠間差異沒有顯著性。

表1 H1N1感染小鼠肺組織病毒拷貝數(shù)Tab.1 Virus copy number ofm ice infected with H1N1 virus

2.4 小鼠肺組織病理觀察結(jié)果

感染H1N1流感病毒后，各品系小鼠肺組織均出現(xiàn)了一定程度的損傷，其中BALB/c-nu小鼠的損傷面積最小，SCID小鼠的損傷面積最大，但統(tǒng)計學(xué)上差異沒有顯著性（圖3）；C57BL/6小鼠和NOD/ LtJ小鼠7 d的病變面積較4 d有所局限縮小，BALB/c小鼠、SCID小鼠、BALB/c-nu小鼠和NODSCID小鼠7 d的病變面積較4 d略有擴大，但均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 不同品系小鼠感染H1N1流感病毒后肺組織損傷面積比例Fig.3 Percentage of lung lesion area in different laboratory mouse strains after infection with influenza A（H1N1）virus

除肺組織損傷的病變面積不同外，各品系小鼠肺組織的病變特點也不盡相同。從肺組織病理改變看，C57BL/6小鼠感染初期表現(xiàn)為較彌漫的間質(zhì)性肺炎，血管擴張充血，周圍水腫，有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管上皮較完整，肺泡間隔增寬，肺泡受壓變形，腔內(nèi)有炎細(xì)胞；感染后期病變逐漸局限，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)增生，滲出的炎細(xì)胞逐漸減少。與野生型C57BL/6小鼠相比，BALB/c小鼠和其余四種免疫缺陷型小鼠感染后病變隨病程進(jìn)展不斷加重，沒有恢復(fù)好轉(zhuǎn)，這與存活情況和體重減少的結(jié)果相一致。除了出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎和血管變化外，由于缺乏清除病毒的免疫機制，免疫缺陷小鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)了變性壞死和脫落，SCID小鼠和NOD/ LtJ小鼠感染后7 d和NOD-SCID小鼠感染后4 d和7 d表現(xiàn)尤為嚴(yán)重。與C57BL/6小鼠肺組織內(nèi)多種炎癥細(xì)胞的浸潤參與炎癥反應(yīng)對抗病毒感染不同，免疫缺陷小鼠的肺組織內(nèi)炎細(xì)胞數(shù)量很少，SCID小鼠以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主，NOD/LtJ小鼠以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，BALB/c-nu小鼠以中性粒細(xì)胞為主，NOD-SCID小鼠僅有少量的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞（圖4，見彩插1）。

3 討論

在流感病毒的初次感染中，固有免疫和適應(yīng)性免疫在病毒的清除和病變的局限中都起著重要的作用。我們使用甲型H1N1病毒A/California/7/ 2009（CA7）株感染野生型和4種免疫缺陷型小鼠，觀察各品系小鼠病毒感染和肺組織的病理改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品系的小鼠感染流感病毒，由于宿主本身的免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)不同，所以對病毒的反應(yīng)存在差異。

從動物死亡情況看，野生型的C57BL/6小鼠的存活率最高，為50％；BALB/c小鼠和各免疫缺陷品系的小鼠死亡率均為100％。其中，NK細(xì)胞缺陷的NOD/LtJ小鼠感染早期即開始大量死亡；T細(xì)胞缺陷的BALB/c-nu小鼠在中晚期大量死亡。從動物體重減低的情況看，C57BL/6小鼠感染后體重下降后又回升；BALB/c小鼠和各免疫缺陷品系小鼠感染病毒后體重隨病情發(fā)展快速下降，直至死亡。這說明在病毒感染早期，NK細(xì)胞起到重要的清除病毒的作用，NK細(xì)胞缺陷的小鼠感染流感病毒后很快出現(xiàn)死亡；而在感染晚期主要由特異性的T細(xì)胞清除病毒，T細(xì)胞缺陷小鼠在感染中晚期大量死亡。NK細(xì)胞被認(rèn)為不僅在對抗病毒感染的固有免疫過程中發(fā)揮作用，同時在調(diào)節(jié)病毒特異的適應(yīng)性免疫中也起到重要作用。然而之前的研究也發(fā)現(xiàn)，雖然NK細(xì)胞在病毒感染早期的固有免疫中有重要的作用，但流感病毒發(fā)展出逃避固有免疫的能力［2，3］，病毒能夠降低NK細(xì)胞的活性［4］。而且除了NK細(xì)胞，固有免疫還有DC、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞和組分參與作用，所以BALB/c小鼠與NOD/ LtJ小鼠，SCID小鼠與NOD-SCID小鼠間在死亡率上并沒有明顯的差異。這些結(jié)果說明在甲型H1N1流感感染的過程中NK細(xì)胞的缺陷影響到感染早期動物的存活，但對整個發(fā)病的預(yù)后并沒有起到?jīng)Q定性的影響。T、B細(xì)胞聯(lián)合缺陷的SCID小鼠較T細(xì)胞單獨缺陷的小鼠更早出現(xiàn)死亡，體重下降也更為明顯，說明B細(xì)胞在流感病毒的感染中起到至關(guān)重要的作用。之前也有研究表明流感的初次感染中，單獨B細(xì)胞缺陷的小鼠和同時缺乏B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的小鼠均不能抵抗病毒的感染，前者盡管也有大量的CD8+T細(xì)胞浸潤但仍然不能抵抗病毒的感染。但單獨CD4+T細(xì)胞缺陷的小鼠卻僅僅引起病毒清除的延遲，但仍能存活下來［5］，所以在T細(xì)胞對抗流感病毒的過程中，CD8+T細(xì)胞的作用可能占主導(dǎo)作用。

從肺組織病理改變看，C57BL/6小鼠感染由彌漫的間質(zhì)性肺炎逐漸局限；BALB/c小鼠和其余四種免疫缺陷型小鼠感染后病變隨病程進(jìn)展不斷加重，沒有恢復(fù)好轉(zhuǎn)，這與存活情況和體重減少的結(jié)果相一致。除了出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎和血管變化外，由于缺乏清除病毒的免疫機制，免疫缺陷小鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)了變性壞死和脫落。但由于各品系小鼠的免疫系統(tǒng)表型的差異，肺組織中浸潤的炎細(xì)胞種類也有差異，但除了相應(yīng)的淋巴細(xì)胞數(shù)量減少外，其他組分的炎癥細(xì)胞由于缺乏相應(yīng)的刺激和誘導(dǎo)因子，對流感病毒感染的反應(yīng)也有所降低，參與炎癥反應(yīng)的數(shù)量減少。由此可知流感病毒感染中，NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞除了直接的病毒殺傷作用和抗體中和作用外，對其他炎癥細(xì)胞的活化和誘導(dǎo)也起著重要的作用。但BALB/c小鼠雖然免疫系統(tǒng)沒有顯著缺陷，但肺組織內(nèi)的炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯少于C57BL/6小鼠肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量，造成這一現(xiàn)象的具體機制還有待于進(jìn)一步研究。

［1］鮑琳琳，孫惠惠，占玲俊，等.A/California/7/2009與A/ California/4/2009病毒感染力比較［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（1）：6-9.

［2］Heltzer，ML，Coffin SE，Maurer K，et al.Immune dysregulation in severe influenza［J］.J Leukoc Biol.2009.85：1036-1043.

［3］Gobbo D，Villani N，Marini S，et al.Suppressor cells induced by influenza virus inhibit interleukin-2 production in mice［J］.Immunology 1990.69：454-459.

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［5］Wu HY，Haist V，BaumgartnerW，et al.Sustained viral load and late death in Rag2-/-mice after influenza A virus infection［J］.Virol J，2010，7：172，doi：10.1186/1743-422X-7-172.