均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化柔紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基

潘淑勇

(魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂276006)

臨床上鹽酸柔紅霉素是治療急性非淋巴細(xì)胞性白血病的一線藥物，對(duì)兒童白血病也有良好的緩解作用，同時(shí)也是去甲氧柔紅霉素、阿霉素和表柔比星的合成起始原料。隨著人類(lèi)癌癥發(fā)病率的逐年上升，鹽酸柔紅霉素的市場(chǎng)容量也在快速提高。2009年柔紅霉素、阿霉素和表柔比星均被收錄到《國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)藥品目錄》。然而較低的發(fā)酵效價(jià)造成了昂貴的生產(chǎn)成本，致使售價(jià)居高不下。降低生產(chǎn)成本，減少患者的負(fù)擔(dān)是我們當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。

1978年王元和方開(kāi)泰提出了均勻設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)考慮如何將設(shè)計(jì)點(diǎn)均勻地散布在試驗(yàn)范圍內(nèi)，使得能用較少的試驗(yàn)點(diǎn)獲得最多的信息。多年來(lái)，均勻設(shè)計(jì)在國(guó)內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用，并獲得不少好的成果。本次研究將采用均勻設(shè)計(jì)的方法，優(yōu)化柔紅霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，以期進(jìn)一步提高發(fā)酵效價(jià)，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 親本:Dau G22:發(fā)酵效價(jià)為2 198 mg·L－1。保存于魯南制藥科研部。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子搖瓶培養(yǎng)基:玉米淀粉4.0%，葡萄糖1.0%，麩皮1.0%，麩質(zhì)粉0.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO40.1%，CaCO30.4%，pH自然。裝60 mL于500 mL搖瓶中，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基:玉米淀粉7.0%，麩皮1.0%，麩質(zhì)粉0.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%;pH自然。裝30 mL于250 mL搖瓶中，121℃滅菌30 min。

1.1.3 色譜條件 高壓液相色譜Agilent C18色譜柱(53 mm ×7 mm，3 μm);流動(dòng)相:15 mmol·L－1的磷酸二氫鉀－乙腈(1∶1);柱溫25℃;流速1.0 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 將Dau G22的工作細(xì)胞庫(kù)接入種子搖瓶，接種量1 mL，于29℃搖床中220 rpm培養(yǎng)42 h。再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，接種量10%，每個(gè)菌株接種3個(gè)搖瓶，于28℃搖床中220 rpm培養(yǎng)168 h。高壓液相測(cè)定效價(jià)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基設(shè)計(jì)采用均勻設(shè)計(jì)表U*10(108)，S=3，D=0.168 1，見(jiàn)表1［1］。

表1 ，S=3

表1 ，S=3

1 5 6 1 1 5 7 2 10 3 3 3 4 10 2 4 4 9 6 5 5 3 2 6 6 8 9 7 7 2 5 8 8 7 1 9 9 1 8 10 10 6 4

將發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基的玉米淀粉、麩皮、麩質(zhì)粉3種成分作為3個(gè)因素進(jìn)行10水平的實(shí)驗(yàn)，各因素水平分布見(jiàn)表2。

表2 各因素水平分布

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 計(jì)算平均效價(jià)，數(shù)據(jù)分析使用SAS 9.0軟件，做二次曲面回歸，得出最佳配方。

1.2.4 驗(yàn)證 將分析得到的配方用搖瓶發(fā)酵進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2 數(shù)據(jù)分析 使用SAS軟件做二次曲面回歸得到回歸方程:Y=－6 396.5+1 977.1［玉米淀粉］+5 559.6［麩皮］－8 560.7［麩質(zhì)粉］+6.3［玉米淀粉］2－1 670.6［玉米淀粉］×［麩皮］－217.7［玉米淀粉］×［麩質(zhì)粉］+10 355［麩皮］×［麩質(zhì)粉］

顯著性影響見(jiàn)表4。

表3 搖瓶發(fā)醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 3個(gè)因素的F值和P值

P值均 ＜0.5，因此3個(gè)因素對(duì)發(fā)酵效價(jià)均有顯著影響。

SAS預(yù)測(cè)當(dāng)［玉米淀粉］=12.4%，［麩皮］=1.1%，［麩質(zhì)粉］=1.5%時(shí)發(fā)酵效價(jià)達(dá)到最大為:2 606 mg·L－1

2.3 發(fā)酵效價(jià)的驗(yàn)證 根據(jù)分析結(jié)果，使用如下培養(yǎng)基再次發(fā)酵驗(yàn)證預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性:玉米淀粉12.4%，麩皮1.1%，麩質(zhì)粉1.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%; pH自然。實(shí)驗(yàn)方法同上所述。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 優(yōu)化后培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵效價(jià)

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)最高發(fā)酵效價(jià)為2 703 mg·L－1，比原培養(yǎng)基發(fā)酵效價(jià)提高23%，SAS預(yù)測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確。

3 小結(jié)

均勻設(shè)計(jì)是我國(guó)科學(xué)家自主發(fā)明的一種優(yōu)秀的設(shè)計(jì)方法，在我國(guó)的火箭等尖端科學(xué)研究中發(fā)揮了重要的作用，我們應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了柔紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的改良，為進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，降低患者負(fù)擔(dān)發(fā)揮了一定的作用。

［1］ 峁詩(shī)松，王靜龍，史定華.統(tǒng)計(jì)手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2003:751.