VEGF對兔骨髓細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)作用

孫 華，宋開茂，王 敏，王小瓊

(1.解放軍蘭州軍區(qū)療養(yǎng)院第二療養(yǎng)區(qū)口腔科，陜西西安 710600;

2.解放軍273醫(yī)院口腔科，新疆 庫爾勒841000

3.西安建筑科技大學(xué)醫(yī)院口腔科，陜西西安 710055)

VEGF對兔骨髓細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)作用

孫 華1，宋開茂2，王 敏1，王小瓊3

(1.解放軍蘭州軍區(qū)療養(yǎng)院第二療養(yǎng)區(qū)口腔科，陜西西安 710600;

2.解放軍273醫(yī)院口腔科，新疆 庫爾勒841000

3.西安建筑科技大學(xué)醫(yī)院口腔科，陜西西安 710055)

目的:觀察血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對兔骨髓細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。方法:應(yīng)用終未濃度為5 ng/mL的人重組rhVEGF體外誘導(dǎo)培養(yǎng)兔骨髓細(xì)胞，并與骨片共同培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)后3、6、9d用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate－resistant acid phosphatase，TRAP)染色進(jìn)行破骨細(xì)胞鑒定計(jì)數(shù)和骨片吸收陷窩數(shù)目的統(tǒng)計(jì)。結(jié)果:誘導(dǎo)培養(yǎng)3d，實(shí)驗(yàn)組與對照組的破骨細(xì)胞數(shù)和骨吸收陷窩數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)，而隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間延長，實(shí)驗(yàn)組兩者的數(shù)量明顯增加，在誘導(dǎo)培養(yǎng)6d和9d時，均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:VEGF具有體外誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的作用。

人重組血管內(nèi)皮生長因子;兔;破骨細(xì)胞

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2011，21(1):11］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(1):11］

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)是主要的血管形成因子，又是骨生長因子，與骨代謝關(guān)系密切。VEGF是近年來研究較多的細(xì)胞因子，其在骨代謝過程中協(xié)調(diào)著骨細(xì)胞的消長、細(xì)胞外基質(zhì)的改建及骨形成、骨吸收間的關(guān)系［1－3］。然而至今，VEGF對破骨細(xì)胞形成及功能的作用未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞進(jìn)一步了解VEGF的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設(shè)備

新生兔(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)。

α－MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國);胎牛血清(浙江金華);rhVEGF(北京中杉 );甲苯胺藍(lán) (sigma公司);Leica 1600硬組織切片機(jī)(徠卡儀器有限公司，瑞士);YMT－Z倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 骨磨片的制備

取新鮮小牛皮質(zhì)骨，手鋸修成1.4 cm×1.4 cm大小，用100目砂紙打磨光滑后，在Leica硬組織切片機(jī)上切成30 μm厚度的薄片，梯度乙醇脫水，超聲水浴清洗10 min×3次，自然干燥，鉛筆標(biāo)記正反面后，放入24孔板中，γ－射線照射消毒后備用。將1.0 cm×1.0 cm大小的細(xì)胞爬片(蓋玻片)超聲震蕩洗滌后浸入硫酸－重鉻酸鉀清潔液中過夜，充分水洗擦干，高壓滅菌，放入24孔板中備用。

1.2.2 兔骨髓破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)

新生兔斷頸處死后，置于750 mL/L的乙醇溶液中浸泡5 min，無菌條件下分離股骨、脛骨。超凈工作臺內(nèi)剪斷長骨兩骺端，暴露骨髓腔，用10 mL一次性注射器抽取含100 mL/L胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔。收集全部沖洗液，篩網(wǎng)濾過，1 000 r/min離心棄部分上清液，吹打均勻，重懸于含100 mL/L胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)液中，光鏡下調(diào)整單核細(xì)胞密度為1.5×107/mL。將細(xì)胞懸液分別接種于放置有細(xì)胞爬片以及骨片的24孔培養(yǎng)板(每孔 0.5 mL)，在 37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度下培養(yǎng)2 h，半量換液。第3天，棄原培養(yǎng)液，分別將置有骨片和細(xì)胞爬片的培養(yǎng)孔各隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組18孔。實(shí)驗(yàn)組加入含 rhVEGF終未濃度為 5 ng/mL、胎牛血清100 mL/L的α－MEM培養(yǎng)液;對照組加入不含rh-VEGF的 α－MEM培養(yǎng)液(含100 mL/L胎牛血清)，繼續(xù)培養(yǎng)，共培養(yǎng)9d，每48 h換液1次，并始終維持實(shí)驗(yàn)組rhVEGF濃度不變。

1.2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate－resistant acid phosphatase，TRAP)染色

分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、6、9天，實(shí)驗(yàn)組、對照組各取出6張細(xì)胞爬片，PBS沖洗后，用25 mL/L戊二醛4℃固定30 min，放入孵育液內(nèi)(0.1 mol/L醋酸緩沖液18 mL，六偶氮副品紅1 mL，萘酚AS－BI磷酸鹽20 mg，酒石酸鉀鈉50 mmol)，37℃孵育30 min，取出細(xì)胞爬片，蒸餾水沖洗，中性樹膠封片，倒置顯微鏡觀察。TRAP染色陽性的多核細(xì)胞(2個或2個以上核)為破骨細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)和照像。

1.2.4 各組骨片上的吸收陷窩觀察

分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、6、9天，實(shí)驗(yàn)組、對照組各取出6枚骨片，25 mL/L戊二醛固定30 min，1g/L甲苯胺藍(lán)硼酸鹽溶液染色2 min。然后置于0.25 mol/L的氨水中超聲振蕩2 min以去除附著的細(xì)胞，再用上述染液復(fù)染5 min，丙酮脫水，室溫干燥，光鏡下觀察并進(jìn)行吸收陷窩計(jì)數(shù)和照像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后破骨細(xì)胞形成情況

TRAP染色后，倒置顯微鏡下可見破骨細(xì)胞胞漿呈酒紅色陽性染色，多核，主要位于細(xì)胞中央且未染色，類似于煎蛋樣(圖1)，實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)培養(yǎng)第3天，破骨細(xì)胞數(shù)與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天，鏡下可見相鄰單核細(xì)胞胞突起融合現(xiàn)象，可見少量多核細(xì)胞開始形成。誘導(dǎo)培養(yǎng)第6天以后，多核細(xì)胞大量出現(xiàn)。細(xì)胞形態(tài)呈圓形、多角形或規(guī)則形，邊緣不整齊，突起較多，胞體較大，核數(shù)目2或2以上不等。實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞數(shù)在第6天和第9天兩個時間點(diǎn)均明顯多于對照組(P＜0.05)，組內(nèi)相比第6天和第9天相比無顯著性差異(P＞0.05)，但均明顯高于第3天(P＜0.05)。對照組隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，破骨細(xì)胞數(shù)量并未增加，而后期逐漸減少(表1)。

圖1 破骨細(xì)胞TRAP染色陽性，細(xì)胞呈油煎雞蛋樣，胞漿酒紅色(200×)

2.2 骨片共同培養(yǎng)時吸收陷窩出現(xiàn)情況

破骨細(xì)胞及其吸收骨質(zhì)后所形成的骨吸收陷窩經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后呈深藍(lán)色，直徑大小不一，多為單個圓形或橢圓形，少數(shù)為不規(guī)則形，邊界不整齊(圖2)。誘導(dǎo)培養(yǎng)3d時，實(shí)驗(yàn)組和對照組骨吸收陷窩數(shù)無顯著差異(P＞0.05)，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間延長，實(shí)驗(yàn)組骨吸收陷窩數(shù)逐漸增多，在6d和9d兩時間均明顯高于對照組(P＜0.05)，但組內(nèi)相比，6d和9d無顯著性差異(P＞0.05)。對照組隨培養(yǎng)時間延長，骨吸收陷窩數(shù)無明顯增加(表1)。

圖2 破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后呈深藍(lán)色(200×)

表1 rhVEGF誘導(dǎo)培養(yǎng)后破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩形成情況(n=6，±s)

表1 rhVEGF誘導(dǎo)培養(yǎng)后破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩形成情況(n=6，±s)

*相同時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比P＜0.05;不同字母為各組不同時間點(diǎn)相比P ＜0.05

培養(yǎng)時間(d)破骨細(xì)胞數(shù) 骨吸收陷窩數(shù)對照組 實(shí)驗(yàn)組3 8.79 ±2.86A 8.56 ±2.79A 2.05 ±0.15A 2.15 ±0.07對照組 實(shí)驗(yàn)組A 6 10.92 ±3.18A 18.16 ±3.05*B 2.71 ±0.82A 6.64 ±1.82*B 9 8.85 ±0.17A 21.24 ±3.88*B 2.34 ±0.13A 7.15 ±2.03*B

3 討論

破骨細(xì)胞是骨組織中的多核巨細(xì)胞，其來源于造血干細(xì)胞中的粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落(GMCFU)形成單位。在適宜的刺激下，干細(xì)胞(stem cell)分化成具有破骨細(xì)胞表型的單核細(xì)胞(monocyte)，進(jìn)而融合為成熟的多核破骨細(xì)胞，參與骨吸收過程［1］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在骨代謝過程中具有協(xié)調(diào)骨細(xì)胞的消長、細(xì)胞外基質(zhì)的改建、骨形成和骨吸收等作用。體外在破骨細(xì)胞培養(yǎng)中加入VEGF后，破骨細(xì)胞的數(shù)量增多、功能增強(qiáng)。Qian Zhang等［2］研究證實(shí)VEGF可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、成熟，維持骨髓功能，且達(dá)到類似于巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M－CSF)起的作用。有學(xué)者將人重組血管內(nèi)皮生長因子(rhVEGF)局部注射于正畸牙周圍牙齦，發(fā)現(xiàn)注射組比對照組牙周破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多，且破骨細(xì)胞數(shù)目與注射rhVEGF的劑量成正比。之后，其又進(jìn)行anti－VEGF多克隆抗體的實(shí)驗(yàn)，將anti－VEGF注射于正畸牙周圍牙齦，發(fā)現(xiàn)牙周破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，牙的移動和復(fù)發(fā)受到抑制，從反面證實(shí)了VEGF的作用［3］。

為進(jìn)一步探討VEGF對破骨細(xì)胞及功能的影響，本實(shí)驗(yàn)采用rhVEGF體外誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，觀察其促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和功能的作用。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)液中加入5 ng/mL濃度的rhVEGF，破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯增多且骨吸收功能增強(qiáng)。分析原因可能是:骨髓單個核細(xì)胞主要為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞膜上具有VEGF受體(VEGFR1和VEGFR2)，加入VEGF后，VEGF與VEGFR1結(jié)合使局部黏附激酶(FAK)中的酪氨酸磷酸化，激活破骨細(xì)胞的胞外基質(zhì).整和素FAK的信號傳導(dǎo)通道，促進(jìn)其不斷增殖，趨化，并募集前體細(xì)胞，最終融合形成破骨細(xì)胞［4－5］。另一方面，VEGF還可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。在實(shí)驗(yàn)初期可觀察到少量破骨細(xì)胞，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間延長，到第6天時破骨細(xì)胞大量增多，與骨片共同培養(yǎng)所形成的骨吸陷窩數(shù)亦相應(yīng)的增加。也證實(shí)VEGF的誘導(dǎo)作用。

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［2］Zhang Q，Guo R.VEGF－C.a lymphaticgrowth factor，is a RANKL targetgene in osteoclasts that enhances osteoclastic bone resorption through an autocrine mechanism［J］.J Biolog Chem，2008，283:13491－13499.

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Effect of VEGF on osteoclasts formation from bone marrow cells in rabbit

SUN Hua*，SONG Kai－mao，WANG Min，WANG Xiao－qiong
(*Department of Stomatology，Lin Tong Sanatorium of Lanzhou Military Region，Xi'an 710600，China)

AIM:To observe the inducing effect of recombinant human vascular endothelialgrowth factor(rhVEGF)on osteoclastsdifferentiation from rabbit bone marrow cells.METHODS:Rabbit bone marrow cells were harvested and cultured in the presence or absence of 5ng/mL rhVEGF.Onday 3，6 and 9，the cells were stained with tartrate－resistant acid phosphatase(TRAP)and bone absorption lacunas were counted.RESULTS:Onday 3 after rh-VEGF induction，nodifference was found in the number of TRAP－positive cells and absorption lacunas(P ＞0.05).However，the number of TRAP－positive cells and absorption lacuna were significantly increased onday 6 andday 9 post－rhVEGF induction.CONCLUSION:VEGF can induce osteoclastsdifferentiation in vitro.

rhVEGF;rabbit;osteoclast

R780.2

A

1005－2593(2011)01－0011－03

2010－03－17;

2010－07－09

孫華(1974－)，女，漢族，陜西人。碩士，主治醫(yī)師