重組釉原蛋白的研究進(jìn)展

林智愷 綜述;束 蓉，宋忠臣 審校

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院牙周科，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011)

重組釉原蛋白的研究進(jìn)展

林智愷 綜述;束 蓉，宋忠臣 審校

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院牙周科，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011)

重組釉原蛋白(recombinant amelogenin，rAm)是通過生物工程技術(shù)得到的一類純化蛋白，許多研究結(jié)果證實(shí)其可以促進(jìn)牙周組織再生。而目前對于rAm的結(jié)構(gòu)功能和促進(jìn)牙周組織再生的具體機(jī)制尚不完全清楚，因此近年來有許多關(guān)于rAm各方面的研究。該文從rAm的分類、表達(dá)純化、結(jié)構(gòu)及其對牙周組織再生的促進(jìn)作用和機(jī)制等方面的研究進(jìn)展作一綜述。

重組釉原蛋白;牙周組織再生;結(jié)構(gòu);功能

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2011，21(1):48］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(1):48］

牙周炎病人缺失的牙周組織再生一直是牙周治療的難點(diǎn)和重點(diǎn)，自從20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix proteins，EMPs)可誘導(dǎo)牙骨質(zhì)形成以來，對牙周組織再生的誘導(dǎo)作用日益受到關(guān)注，并進(jìn)行了大量研究。EMPs中的主要成分包括:釉原蛋白(amelogenin，Am)、釉蛋白(enamelin)、釉叢蛋白(tuftlin)等，其中Am是EMPs促進(jìn)牙周組織再生的主要活性成分，含量約占EMPs的90%左右。有學(xué)者通過乙酸法［1］從6月齡豬發(fā)育期的牙胚中提取了EMPs，經(jīng)純化凍干后可得到釉基質(zhì)衍生物(enamel matrixderivative，EMD)。國外已有商品化生產(chǎn)的豬基質(zhì)蛋白衍生物emdogain?，它是一種混合蛋白，具體成分還不清楚，其中90%以上為豬釉原蛋白，并可能含有骨形成蛋白樣生長因子［2］，但不含釉蛋白、釉叢蛋白等［3］?，F(xiàn)已有大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證明:在牙周炎治療中應(yīng)用emdogain?可以促進(jìn)牙周組織再生。

豬釉基質(zhì)蛋白衍生物因獲取困難，成本高昂，每次提取產(chǎn)量有限，而且不是純凈的釉原蛋白等缺點(diǎn)。近年來通過基因工程學(xué)和生物工程技術(shù)，克隆釉原蛋白的成熟肽編碼區(qū)基因，再構(gòu)建表達(dá)載體，表達(dá)并分離純化，可得到單一組分重組釉原蛋白(recombinant amelogenin，rAm)，具有來源廣泛，性質(zhì)穩(wěn)定，能批量純化獲得等優(yōu)點(diǎn)，近年來，已有大量與rAm相關(guān)的研究報(bào)道。本文就rAm分類、表達(dá)純化、結(jié)構(gòu)組成、對牙周組織再生的作用和機(jī)制等幾個方面作一綜述。

1 rAm的分類

通過重組得到的rAm按種屬來源主要有以下幾類:重組人釉原蛋白(recombinant human amelogenin rHAm)，例如含有175個氨基酸的 rH175等［4］，重組豬釉原蛋白(recombinant porcine amelogenin rPAm)，例如含有172個氨基酸的rP172等，重組鼠釉原蛋白(recombinant murine amelogenins rMAm)，例如不含組氨酸標(biāo)記的rM179和含有組氨酸標(biāo)記的rp(H)M180等［5］。按照rAm的分子量可分為:25×103全長重組釉原蛋白(full－length recombinant amelogenin)，20×103親水C端24個氨基酸被降解的重組釉原蛋白降解片段［6］。最近，有研究者還重組了一些低分子量釉原蛋白A+4(包含外顯子 2、3、4、5、6、7d)、A －4 又稱富亮氨酸釉原蛋白片段(leucine－rich amelogenin peptide，LRAP，包含外顯子2、3、5、6、7d)和5 ×103富酪氨酸釉原蛋白片段 (tyrosine－rich amelogenin peptide，TRAP)等，有研究表明他們可能起細(xì)胞信號分子的作用［7］。

2 rAm的表達(dá)和純化

rAm常用的表達(dá)純化體系主要有兩類:一類為原核表達(dá)體系，該類體系應(yīng)用已近二十余年，通過不斷改進(jìn)和完善，已比較成熟，可以得到較穩(wěn)定的產(chǎn)量。其基本途徑為利用限制性內(nèi)切酶將rAm的cDNA插入原核表達(dá)載體(質(zhì)粒)，再將重組完成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌中(Escherichia coli)，使之成為表達(dá)rAm蛋白的工程菌，誘導(dǎo)表達(dá)得到融合的rAm;最后通過親和層析純化，收集純化的rAm［8］。另一類為真核表達(dá)體系，這是一類比較新，而且研究報(bào)道較少的表達(dá)體系。Taylor AL等(2006)［9］首先構(gòu)建了hAm慢病毒重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf 9，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，這種方法可以獲得產(chǎn)量約為4～10 mg/L的rHAm。趙川江等［10］也在真核表達(dá)方面做了有益的嘗試，他們重組的質(zhì)粒PcDNA3.1－AMG在體外轉(zhuǎn)染哺乳動物COS1細(xì)胞后能夠表達(dá)。

3 rAm的結(jié)構(gòu)

人的釉原蛋白基因定位于Xp22.1－p22.3和Yp11.2，其中90%X染色體轉(zhuǎn)錄表達(dá)，10%Y染色體轉(zhuǎn)錄表達(dá)［11］。人、豬的釉原蛋白基因都包含至少7個外顯子(exon)，而牛的釉原蛋白基因只有6個exon，人、豬等的exon 4在轉(zhuǎn)錄過程中通常經(jīng)過選擇性剪切后被切除。另外還有研究發(fā)現(xiàn)在人、小鼠等的釉原蛋白基因組中存在exon 8、exon 9但缺少exon 7的一些特殊釉原蛋白基因［12］。

許多學(xué)者對重組釉原蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)rAm是一類含有親水C端的疏水大分子［13］。Zou Y等［14］分析了重組鼠釉原蛋白M180的氨基酸組成，含有24.4%疏水性脯氨酸、13.9%谷氨酰胺和13個Gln－Pro－Xaa重復(fù)氨基酸序列，二級結(jié)構(gòu)在N端A區(qū)域包括兩個螺旋和一個β鉸鏈，剩余區(qū)域?yàn)闊o規(guī)則卷曲，并且提示M180可能沒有穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)。關(guān)于rAm的確切結(jié)構(gòu)及其功能的關(guān)系以及特定結(jié)構(gòu)域的作用等方面仍不清楚。

4 rAm對牙周組織再生的作用和機(jī)制

Haze A等［15］將溶解于PGA載體的重組人釉原蛋白(rHAm)作為實(shí)驗(yàn)組，以單純PGA載體為陰性對照組，以粗提的牛釉基質(zhì)蛋白(EMPs)為陽性對照組，分別作用于已預(yù)先建立了牙周炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?月齡雌性獵狗牙周組織上，通過Micro－CT和組織切片分析發(fā)現(xiàn):實(shí)驗(yàn)組兩周時(shí)首先開始有新生牙骨質(zhì)形成，然后逐漸有牙周韌帶和牙槽骨的再生，在4～8周后就可觀察到以上3種牙周組織的明顯生長，在電鏡觀察下可看到在新形成的牙骨質(zhì)與牙周膜韌帶之間有Sharpey纖維的附著，而相比較下對照組牙周支持組織則無明顯的再生。Yagi Y等［16］報(bào)道:將一定濃度的重組豬釉原蛋白(rPAm)作用于SD大鼠的牙根后，在體內(nèi)可抑制牙根吸收、牙骨質(zhì)吸收，對促進(jìn)牙周組織的再生有積極的作用。因此，rAm可以促進(jìn)牙周支持組織的再生，并可以形成牙周新附著，有助于改善牙周炎病人的預(yù)后。一些研究報(bào)道證實(shí):rAm主要由以下幾種可能的機(jī)制促進(jìn)牙周組織再生。

4.1 rAm對各種牙周相關(guān)細(xì)胞的作用

關(guān)于rAm對于各類牙周相關(guān)細(xì)胞的作用，許多研究都得出了相似結(jié)論:rAm作用于不同的細(xì)胞會產(chǎn)生不同的作用效果。Li等［17］將重組的全長豬釉原蛋白(rPAm)分別作用于牙周成纖維細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞和牙齦上皮細(xì)胞，觀察對各類細(xì)胞黏附、增殖和遷移的影響，結(jié)果顯示:rPAm可顯著促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，且存在劑量依賴性，僅高濃度的rPAm可促進(jìn)黏附;rPAm可促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞增殖，但抑制遷移，對黏附無明顯影響;rPAm抑制牙齦上皮細(xì)胞的黏附、增殖和遷移，且與劑量相關(guān)。Hatakeyama J等［18］通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):rPAm和LRAP(leucine－rich amelogenin peptide)可以明顯刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞的增殖和遷移。

rAm對于各類細(xì)胞作用的具體機(jī)制和信號途徑尚未完全明了，David MZ［19］的研究發(fā)現(xiàn):重組鼠釉原蛋白對于牙周膜細(xì)胞可產(chǎn)生類生長素樣作用，從而促進(jìn)其黏附及增殖。另有一些研究發(fā)現(xiàn):rPAm和LRAP能夠發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的功能，與跨膜蛋白 LAMP－1、LAMP－2以及 CD63結(jié)合，啟動胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮效應(yīng)，并且rAm與這3個蛋白受體結(jié)合的具體結(jié)合區(qū)的氨基酸序列也有研究報(bào)道［14，20－21］。Matsuzawa M 等［22］報(bào)道:全長的重組鼠釉原蛋白可能作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子而參與Wnt/β－catenin信號途徑，從而引起對牙周膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞的一系列效應(yīng)。

4.2 rAm調(diào)節(jié)成骨和破骨細(xì)胞活性

牙槽骨是重要牙周支持組織，對成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞在骨的吸收、改建和再生過程中發(fā)揮著重要的作用。Svensson J等［8］用重組的鼠釉原蛋白處理原代人成骨細(xì)胞，與未經(jīng)處理的成骨細(xì)胞相比，其活性有顯著提高，骨鈣分泌量平均提高了一倍。Miyuk等［23］研究發(fā)現(xiàn):rAm可以通過抑制成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL、M－CSF和纖連蛋白，從而下調(diào)破骨細(xì)胞的形成和活性。Hatakeyam J等［18］通過實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)論。以上研究結(jié)果提示:rAm可通過上調(diào)成骨活性促進(jìn)新生牙槽骨的形成;通過抑制破骨細(xì)胞的活性而降低牙根和牙槽骨的吸收，從而有利于牙周組織再生。

4.3 rAm募集多能成體干細(xì)胞

牙周組織中存在一類CD44+CD105+STRO－1+多能成體干細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞)，這類細(xì)胞可以在一定條件下分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等，在牙周炎癥控制和組織再生中發(fā)揮著重要作用［24］。體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)都顯示了rAm可以直接或間接作用于這類成體干細(xì)胞，招募干細(xì)胞到炎癥、創(chuàng)傷區(qū)域促進(jìn)組織愈合［15，25］。Goldberg M等［26］報(bào)道:將低分子量的重組釉原蛋白(A+4和A－4)植入小鼠的口腔黏膜，可在炎性細(xì)胞中招募間充質(zhì)干細(xì)胞并促進(jìn)其增殖、分化為類成骨樣細(xì)胞和類成牙本質(zhì)樣細(xì)胞。

4.4 rAm刺激血管形成

rAm可以直接或間接地促進(jìn)新生血管的形成，給予組織再生提供更好的血液供應(yīng)、營養(yǎng)環(huán)境和物質(zhì)代謝，這也是rAm促使牙周組織再生的一個可能的重要作用，但不同的實(shí)驗(yàn)對單一rAm是否能顯著促進(jìn)血管形成得出了不同的結(jié)論。Kauvar AS等［27］報(bào)道:應(yīng)用真核表達(dá)體系得到的重組人釉原蛋白(rHAM+)可以在體內(nèi)顯著刺激發(fā)育中小雞卵絨毛膜尿囊膜的新生血管形成，其他一些體外實(shí)驗(yàn)也表明rAm能夠增進(jìn)組織血管化［28］。但是JohnsondL等［29］將不同濃度的重組豬釉原蛋白(rPAm)作用于人微血管上皮細(xì)胞，結(jié)果在體外未能明顯誘導(dǎo)血管形成，得出單純r(jià)Am相比EMD不能顯著促進(jìn)血管形成的結(jié)論?？傊蟛糠值难芯拷Y(jié)果傾向于rAm有利于新生血管形成，但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證rAm對于血管形成的具體作用和機(jī)制。

5 結(jié)束語

目前，常用的全長rAm主要有rHAm、rPAm、rMAm三種，另外還有一些低分子量的rAm剪切片段，如A－4、A+4等，具有發(fā)揮信號分子的作用。通過原核表達(dá)的方法已經(jīng)可以得到穩(wěn)定的rAm產(chǎn)量，而關(guān)于rAm真核表達(dá)的研究近年來也有很大的進(jìn)展，并可能是今后表達(dá)純化rAm的一個新的熱點(diǎn)研究方向。雖然不少學(xué)者對rAm的基因和具體蛋白結(jié)構(gòu)與其功能關(guān)系作了研究，但迄今為止仍不完全清楚。大量研究表明rAm通過對各類牙周相關(guān)細(xì)胞不同作用、調(diào)節(jié)成骨和破骨細(xì)胞活性、募集多能干細(xì)胞、刺激血管形成和作為信號分子等功能，發(fā)揮其促進(jìn)牙周組織再生，利于創(chuàng)傷愈合的作用。但具體的效應(yīng)途徑和分子機(jī)制仍存在疑問，還需進(jìn)一步深入研究。

［1］束蓉，李超倫，劉正，等.豬釉基質(zhì)蛋白的提取及N末端氨基酸序列分析［J］.口腔醫(yī)學(xué)縱橫雜志，1999，15(2):67－68.

［2］Laaksonen M，Sorsa T，Salo T.Emdogain in carcinogenesis:a systematic review of in vitro studies［J］.J Oral Sci，2010 ，52(1):1－11.

［3］Maycock J，Wood SR，Brookes SJ，et al.Characterization of a porcine amelogenin preparation，emdogain，a biological treatment for periodontaldisease［J］.Connect Tissue Res，2002，43(2－3):472－476.

［4］Deutschd，Chityat E，Hekmati M，et al.High expression of human amelogenin in E.coli［J］.Advdent Res，1996，10(2):187－193.

［5］Ryu OH，F(xiàn)incham AG，Hu CC，et al.Characterization of recombinant pig enamelysin activity and cleavage of recombinant pig and mouse amelogenins［J］.Jdent Res，1999，78(3):743－750.

［6］Sun Z，Carpiaux W，F(xiàn)and，et al.Apatite reduces amelogenin proteolysis by MMP－20 and KLK4 in vitro［J］.Jdent Res，2010，89(4):344－348.

［7］Veis A.Amelogeningene splice products:potential signaling molecules［J］.Cell Mol Life Sci，2003，60(1):38 －55.

［8］Svensson J，Andersson C，Reseland JE，et al.Histidine tag fusion increases expression levels of active recombinant amelogenin in Escherichia coli［J］.Protein Expr Purif，2006，48(1):134 －141.

［9］Taylor AL，Haze－Filderman A，Blumenfeld A，et al.High yield of biologically active recombinant human amelogenin using the baculovirus expression system［J］.Protein Expr Purif，2006，45(1):43－53.

［10］趙川江，章錦才，徐琛蓉，等.人釉原蛋白真核表達(dá)載體體外表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性的檢測［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志，2008，2(6):558－563.

［11］Salido EC，Yen PH，Koprivnikar K，et al.The human enamel proteingene amelogenin is expressed from both the X and the Y chromosomes［J］.Am J Humgenet，1992，50(2):303－316.

［12］Baba O，Takahashi N，Terashima T，et al.Expression of alternatively spliced RNA transcripts of amelogeningene exons 8 and 9 and its end products in the rat incisor［J］.J Histochem Cytochem，2002，50(9):1229－1236.

［13］Snead ML，Zeichner－David M，Chandra T，et al.Construction and identification of mouse amelogenin cDNA clones［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1983，80(23):7254－7258.

［14］Zou Y，Wang H，Shapiro JL，et al.Determination of protein regions responsible for interactions of amelogenin with CD63 and LAMP1［J］.Biochem J，2007，408(3):347 －354.

［15］Haze A，Taylor AL，Haegewald S，et al.Regeneration of bone and periodontal ligament induced by recombinant amelogenin after periodontitis［J］.J Cell Mol Med，2009，13(6):1110 －1124.

［16］Yagi Y，Suda N，Yamakoshi Y，et al.In vivo application of amelogenin suppresses root resorption［J］.Jdent Res，2009，88(2):176－181.

［17］Li X，Shu R，Liud，et al.Different effects of 25－kDa amelogenin on the proliferation，attachment and migration of various periodontal cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，394(3):581－586.

［18］Hatakeyama J，Philpd，Hatakeyama Y，et al.Amelogeninmediated regulationof osteoclastogenesis，and periodontal cell proliferation and migration［J］.Jdent Res，2006，85(2):144 －149.

［19］david MZ，Chen LS，Hsu Z，et al.Amelogenin and ameloblastin showgrowth－factor like activity in periodontal ligament cells［J］.Eur J Oral Sci，2006，114(Suppl.1):244－523，254 －256，381－382.

［20］Shapiro JL，Wen X，Okamoto CT，et al.Cellular uptake of amelogenin，and its localization to CD63，and Lamp1－positive vesicles［J］.Cell Mol Life Sci，2007，64:244 －256.

［21］Zhang H，Tompkins K，Garrigues J，et al.Full length amelogenin binds to cell surface LAMP－1 on tooth root/periodontium associated cells［J］.Arch Oral Biol，2010，55(6):417 －425.

［22］Matsuzawa M，Sheu TJ，Lee YJ，et al.Putative signaling action of amelogenin utilizes the Wnt/beta－catenin pathway［J］.J Periodontal Res，2009，44(3):289 －296.

［23］Nishiguchi M，Yuasa K，Saito K，et al.Amelogenin is a negative regulator ofosteoclastogenesis via downregulation of RANKL，M－CSF and fibronectin expression in osteoblasts［J］.Arch Oral Biol，2007，52(3):237 －243.

［24］Chen SC，Marino V，Gronthos S，et al.Location of putative stem cells in human periodontal ligament［J］.J Periodontal Res，2006，41(6):547 －553.

［25］Song ZC，Shu R，Zhang XL.Cellular responses expression profiling of human bone marrow stromal cells stimulated with enamel matrix proteins in vitro［J］.Cell Prolif，2010，43(1):84 －94.

［26］goldberg M，Lacerda－Pinheiro S，Jegat N，et al.The impact of bioactive molecules to stimulate tooth repair and regeneration as part of restorativedentistry［J］.Dent Clin North Am，2006，50(2):277－298.

［27］Kauvar AS，ThomadS，CarnesdL，et al.In vivo angiogenic activity of enamel matrixderivative［J］.J Periodontol，2010，81(8):1196－1201.

［28］Yuan K，Chen CL，Lin MT.Enamel matrixderivative exhibits angiogenic effect in vitro and in a murine model［J］.J Clin Periodontol.2003，30(8):732 －738.

［29］JohnsondL，Carnesd，Steffensen B，et al.Cellular effects of enamel matrixderivative are associated withdifferent molecular weight fractions following separation by size－exclusion chromatography［J］.J Periodontol.2009，80(4):648－656.

Research advance of recombinant amelogenin

LIN Zhi－kai，SHU Rong，SONG Zhong－chen
(Department of Periodontology，School of Stomatology，Ninth People＇s Hospital，School of Medicine Shanghai JiaoTong University;Institute of Shanghai Stomatology，Shanghai 200011，China)

Recombinant amelogenin(rAm)is a kind of purified protein attained by bioengineering technology methods，which can enhance periodontal regeneration.The mechanisms of rAm to promote periodontal tissue formation have not heen fully clavified.This article reviews the recent research advances of rAm in the following four aspects:classification;expression and purification;structure and mechanisms of promoting periodontal tissue regeneration.

recombinant amelogenin;regeneration of periodontal tissue;structure;function

R780.2

A

1005－2593(2011)01－0048－04

2010－08－24

林智愷(1987－)，男，漢族，上海人。碩士生(導(dǎo)師:束蓉)

束蓉，E－mail:shurong123@hotmail.com