IL-2聯(lián)合熱療對SSMC7721細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡的影響

黃 革 陳宏勃 方 卓 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院放射線科，吉林 長春 130041)

IL-2聯(lián)合熱療對SSMC7721細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡的影響

黃 革 陳宏勃 方 卓 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院放射線科，吉林 長春 130041)

目的 觀察白細(xì)胞介素-2(IL-2)聯(lián)合熱療誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株(SSMC7721細(xì)胞)的增殖抑制作用。方法 應(yīng)用MTT比色法檢測不同條件下對SSMC7721細(xì)胞的增殖抑制率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期進(jìn)程的變化，熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 單純熱療組，單純IL-2組及IL-2聯(lián)合熱療組對SSMC7721細(xì)胞的抑制率分別為18.4%、23.7%和46.7%，與對照組相比差別具有顯著性意義。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對增多，細(xì)胞凋亡率升高，組間比較差異顯著。結(jié)論 IL-2聯(lián)合熱療能顯著提高SSMC7721細(xì)胞增殖抑制率，誘導(dǎo)SSMC7721細(xì)胞G1期向S期細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)程，誘導(dǎo)SSMC7721細(xì)胞凋亡。

SMC7721細(xì)胞;IL-2;熱療;細(xì)胞周期;凋亡

熱療與放療、化療顯著的協(xié)同作用已為人們所公認(rèn)，熱療與生物治療聯(lián)合應(yīng)用近年來也倍受關(guān)注〔1〕。本研究應(yīng)用人肝癌細(xì)胞株SSMC7721細(xì)胞為靶點，觀察白細(xì)胞介素-2(IL-2)聯(lián)合熱療對其作用機(jī)制，旨在為人肝細(xì)胞癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑 SSMC7721細(xì)胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，噻唑藍(lán)(MTT)試劑、RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Sigma公司，IL-2、胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 取對數(shù)生長期的SSMC7721細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔100μl，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%匯合時分組，單純熱療組43℃ ±0.2℃持續(xù)加熱40 min，然后移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)。單純IL-2組根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，IL-2最適量為1 000 U/ml。聯(lián)合組在單純IL-2組基礎(chǔ)上再加熱43℃ ±0.2℃ 40 min，然后移入37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)24 h，于結(jié)束前6 h加入MTT試劑20μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸棄上清加入二甲基亞砜150μl/孔，震蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm處測量各孔吸光度A值，按下列公式計算SSMC7721細(xì)胞增殖抑制率。

SSMC7721細(xì)胞抑制率=(1-實驗孔細(xì)胞A值÷對照孔細(xì)胞A值)×100%

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶進(jìn)行，培養(yǎng)結(jié)束后細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上機(jī)前過40目網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測，細(xì)胞周期結(jié)果以Modiffi2.0軟件分析。

1.2.3 熒光染色 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，培養(yǎng)結(jié)束后將熒光染液直接滴入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，熒光染液濃度為吖啶橙(AO)100 μg/ml、溴化乙啶(BB)100 μl等量混合，每孔50 μl，然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，細(xì)胞抑制率t檢驗，細(xì)胞周期組間比較采用F檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 不同條件對SSMC7721細(xì)胞增殖均有影響，與對照組相比差異顯著，且聯(lián)合組效果更顯著。見表1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果 不同條件對SSMC7721細(xì)胞周期各時相均有影響，G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對增多，組間比較差異顯著。見表2。

表1 不同條件對SSMC7721細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s)

表1 不同條件對SSMC7721細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s)

組別 A值 抑制率(%) P值對照組1.52±0.12 － －熱療組 1.24±0.14 18.4% ＜0.01 IL-2組 1.16±0.16 23.7% ＜0.01聯(lián)合組0.82±0.20 46.7% ＜0.01

表2 不同條件對SSMC7721細(xì)胞周期進(jìn)程影響(±s，%)

表2 不同條件對SSMC7721細(xì)胞周期進(jìn)程影響(±s，%)

與對照組G0/G1比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率對照組 31.5±2.1 65.4±3.12) 2.7±1.92)0.8熱療組 43.7±3.91) 39.1±4.72) 17.2±2.42) 12.8 IL-2組 52.4±4.21) 27.2±3.32) 20.1±1.72) 13.6聯(lián)合組 63.6±3.82) 13.6±2.52) 22.8±3.52)21.4

圖1 各組SSMC7721細(xì)胞凋亡情況

2.3 熒光染色結(jié)果 如圖1所示，不同條件對SSMC7721細(xì)胞結(jié)構(gòu)均有促凋亡作用。

3 討論

肝癌是最常見的人類致命性惡性腫瘤，由于發(fā)病隱匿，確診時能夠手術(shù)切除者僅占10%～20%。因此，以非手術(shù)為主的綜合治療已成為肝細(xì)胞癌的主要治療手段〔2〕。熱療因其毒副作用反應(yīng)低，配合放療、化療及生物治療具有顯著的協(xié)同作用。

本研究應(yīng)用IL-2聯(lián)合熱療體外觀察其對SSMC7721細(xì)胞增殖抑制作用，MTT結(jié)果顯示，熱療組，IL-2組及聯(lián)合組對SSMC7721細(xì)胞增殖抑制率為18.4%、23.7%、46.7%，與對照組相比差異具有顯著性意義。但聯(lián)合效果明顯，兩者合用具有協(xié)同作用。因為MTT試劑可被哺乳動物活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成藍(lán)色的甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系。所以，該實驗被廣泛用于抗腫瘤藥物的篩選和細(xì)胞毒性實驗研究，具有一定的客觀性。

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，熱療組、IL-2組及聯(lián)合組對SSMC7721細(xì)胞周期各時相均有影響，組間比較差異顯著，文獻(xiàn)〔3〕報道S期細(xì)胞對熱敏感，受熱后損傷嚴(yán)重，可形成多核細(xì)胞，分裂后死亡，因而導(dǎo)致S期細(xì)胞減少。IL-2主要由CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)功能;可通過熱休克蛋白調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯〔4〕，影響細(xì)胞DNA的合成，阻滯細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化過程，從而使G1期細(xì)胞增多，不能進(jìn)入S期。造成S期細(xì)胞減少，根據(jù)流式細(xì)胞儀結(jié)果初步認(rèn)為IL-2與熱療聯(lián)合應(yīng)用既能抑制細(xì)胞周期G1期的進(jìn)程，又能抑制S期細(xì)胞，從而使G2期/M期細(xì)胞相對增多，而G2期/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反應(yīng)〔6〕。這一點從細(xì)胞凋亡率反映更為明顯。

此外，本研究應(yīng)用熒光技術(shù)對不同條件下的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合染色，BB為菲啶類染料，可嵌入多核苷酸結(jié)構(gòu)，活細(xì)胞膜可排斥BB穿透，而凋亡或死亡細(xì)胞易穿透，故凋亡細(xì)胞被染成黃色，死亡細(xì)胞則呈均勻紅色;AO可穿透活細(xì)胞膜，細(xì)胞被染成綠色，通過熒光顯微鏡極易區(qū)別。

綜上所述，熱療誘使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量熱休克蛋白，具有直接的細(xì)胞毒作用，改變細(xì)胞膜的通透性和流動性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化〔6〕，有利于抗腫瘤藥物的吸收。所以，熱療與化療、放療及生物治療聯(lián)合應(yīng)用具有顯著的協(xié)同作用。

1 高 慧，楊耀琴.熱療與生物治療的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2009;36(3):193-5.

2 宋長城，呂 祥，李 柏，等.抗肝細(xì)胞癌血管生成研究進(jìn)展〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2007;34(2):128-31.

3 Lim CU，Zhang Y，F(xiàn)ox MH，et al.Cell cycle dependentapoptosis and cell cycle blocks induced by hyperthermia in HL-60 cells〔J〕.Int JHyperthermia，2006;22(1):77-91.

4 Kawauchi K，Ihjima K，Yamada O.IL-2 increases human telomerase reverse transcriptase activity transcriptionally and posttranslationally through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt，heart shock protein 90，and mammalian target of rapamycin in transformed NK cells〔J〕.J Immunol，2005;174(9):5261-9.

5 Eillnger-Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like kinase(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells，2000;5(6):491-8.

6 張 威，耿傳營，唐勁天.熱療激發(fā)腫瘤免疫作用研究進(jìn)展〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2008;35(3):166-9.

R739.3

A

1005-9202(2011)12-2237-02

方 卓(1956-)，男，副主任藥師，主要從事抗腫瘤藥物研究。

黃 革(1967-)，男，主管技師，主要從事腫瘤診斷治療研究。

〔2011-03-30收稿 2011-04-02修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)