油菜花粉脂溶性提取物對前列腺癌細胞生長抑制的實驗研究

朱赤紅 杜靈彬 高 赟 錢麗娟 顧琳慧 浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所 杭州 310222曹明富 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院

油菜花粉脂溶性提取物對前列腺癌細胞生長抑制的實驗研究

朱赤紅 杜靈彬 高 赟 錢麗娟 顧琳慧 浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所 杭州 310222曹明富 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院

目的：研究油菜花粉脂溶性提取物（BPE）對體外培養(yǎng)的人前列腺癌細胞的殺傷效應。方法：以人前列腺癌細胞PC-3和DU-145為研究對象，光鏡觀察用藥前后細胞形態(tài)，透射電鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)變化；CCK-8法測定油菜花粉脂溶性提取物對細胞生長抑制率，流式細胞術檢測BPE對PC-3和DU-145細胞周期的影響。結果：不同濃度油菜花粉脂溶性提取物（BPE）對兩株前列腺癌細胞有明顯的抑制作用；形態(tài)學觀察BPE處理后的前列腺癌細胞出現(xiàn)顯著改變；流式細胞儀檢測結果顯示:PC-3及DU-145細胞在油菜花粉脂溶性提取物處理48h后，細胞周期出現(xiàn)變化，G0/G1期比例上升，S期和G2-M期比例下降。結論：油菜花粉脂溶性提取物對兩株前列腺癌細胞的生長有明顯的抑制作用。

油菜花粉脂溶性提取物 人前列腺癌細胞 生長抑制 腫瘤

研究表明，花粉及其組分具有抗腫瘤、抗氧化性、治療前列腺疾病、降血脂及增強機體免疫能力等多種生理功能。本研究選用純度較高的油菜花脂溶性提取物，作用于兩株人激素非依賴性前列腺癌細胞，觀察其對前列腺癌細胞的抑制效應和形態(tài)學變化，為后續(xù)進一步實驗研究打下基礎。

1 實驗材料

1.1 細胞株 非激素依賴型前列腺癌細胞PC-3和DU-145（中國科學院上海細胞所）。

1.2 藥 物 花粉脂溶性提取物（Brassica campestris pollen extract,BPE）（浙江康恩貝制藥公司提供）；F-12培養(yǎng)基（Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；碘化丙啶（PI）（Sigma公司）；CCK-8試劑盒（株式會社同仁化學研究所DOJI NDO）；DNA REAGENT KIT試劑盒（美國BD公司）。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（德國HERAEUS B5060EU公司）；流式細胞儀FAC SCailibur（美國BD公司）；萬能倒置顯微鏡OLYMPUS JMT-2和H-600型電子顯微鏡（日本OLYMPUS）；全波長酶標儀MSS（美國Thermo公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人前列腺癌細胞PC-3和DU-145用F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含15%新生小牛血清，100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、10μg/mL氫化考的松以及0.01U/mL胰島素。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗時選用對數(shù)生長期細胞。

2.2 藥物配制方法 臨用時稱取油菜花粉脂溶性提取物（030401 AA08）適量，DMSO助溶，DMSO最高濃度為0.08%。再用F-12培養(yǎng)液稀釋成不同濃度藥液組。

2.3 BPE對PC-3和DU-145細胞增殖抑制作用的影響 實驗采用CCK-8的方法，取對數(shù)生長期的PC-3和DU-145細胞，制成1×105/mL的細胞懸液，以每孔100μL細胞懸液接種于96孔板上，約1×104/孔，另外每孔加100μL新鮮F-12培養(yǎng)液，總量200μL/孔。每個濃度組設5個復孔。置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按組別換入不同濃度的藥液，最高濃度為4000μg/mL，以2倍濃度稀釋，共8個濃度梯度。對照組換入等體積F-12培養(yǎng)液。待藥物作用48h后，加入CCK-8 10μL/孔,37℃培養(yǎng)箱孵育3h后，在酶聯(lián)免疫測定儀上檢測吸光度（OD值），采用雙波長測定，檢測波長450nm，參比波長630nm。實驗重復3次，取平均值。抑制率（IR）按下列公式計算：細胞增殖抑制率（IR）＝（陰性對照組平均OD值－處理組平均OD值）/陰性對照組平均OD值×100%。

2.4 光鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài) PC-3和DU-145細胞前期處理同前。1000μg/mL藥物作用48h后，取對照和實驗組細胞的培養(yǎng)瓶，顯微鏡下觀察并攝影。藥物作用后收集，2.5%戊二醛固定、1%鋨酸固定、丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂浸透、包埋、超薄切片、以鈾、鉛雙重染色法染色，在H-600型電子顯微鏡下觀察形態(tài)并攝影。

2.5 流式檢測 取BPE刺激過的PC-3和DU-145細胞進行標本處理，調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml的單細胞懸液。800rpm/min離心5min，去上清后加PBS 2mL，混勻離心洗滌2次，棄上清，邊震蕩邊滴入70%乙醇固定，再離心去上清后，按DNA REAGENT KIT試劑盒操作說明進行后續(xù)實驗。流式細胞儀采集窗內(nèi)10 000個細胞，用Modfit LT 2.0軟件分析細胞周期。

3 實驗結果

3.1 不同濃度BPE對前列腺癌細胞抑制率的影響隨著BPE濃度的升高，細胞的抑制率（IR）皆呈上升趨勢，在一定濃度范圍內(nèi)（0～1000μg/mL）隨著BPE濃度的增大，細胞的抑制率越高（F=22.33～197.32,P均＜0.01）。在BPE濃度為1000μg/mL時，PC-3、DU-145細胞的抑制率均達到最高，分別為74.19%、72.77%。但當濃度繼續(xù)升高時，前列腺癌細胞的抑制率反而下降。抑制率下降的程度隨腫瘤細胞株的不同而不同，在BPE濃度為4000μg/mL時，PC-3及DU-145細胞的抑制率分別下降至28.95%和38.47%。不同濃度的BPE處理對腫瘤細胞的抑制率的影響結果表明，兩株前列腺癌細胞對BPE的敏感性略有不同，PC-3和DU-145細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為386μ g/mL和545μg/mL，見圖1。

圖1 不同濃度油菜花粉提取物作用48h后前列腺癌細胞的抑制率

3.2 藥物作用后的前列腺癌細胞形態(tài)學觀察 PC-3與DU-145細胞的對照組細胞細胞增殖旺盛，排列緊密，邊界清楚，有的細胞重疊生長，折光度好，胞質飽滿；實驗組細胞與對照組相比，由于濃度的作用，細胞數(shù)量銳減，細胞排列稀疏、胞膜有破損現(xiàn)象，胞漿內(nèi)有空泡變性，見圖2～5。

PC-3對照組細胞膜完整，細胞胞漿中有豐富的細胞器，細胞膜表面?zhèn)巫恪⑽⒔q毛結構豐富，核膜完整；經(jīng)1000μg/mL濃度BPE作用48h的PC-3細胞可見線粒體腫脹變性，線粒體嵴消失，核結構破壞，細胞表面微絨毛減少，部分脫落。DU-145對照組細胞膜完整，細胞核大，染色質豐富。DU-145經(jīng)1000μg/mL濃度 BPE作用48h后可見胞膜破，胞漿流失，未見明顯的細胞器，見圖6～9。

圖2 PC-3對照組（×100）

圖3 PC-3實驗組48h（×200)

圖4 DU-145對照組（×100)

圖5 DU-145實驗組48h（×200)

圖6 PC-3對照組

圖7 PC-3實驗組48h

圖8 DU145對照組

圖9 DU-145實驗組48h

3.3 BPE對PC-3、DU-145細胞周期的影響 PC-3及DU-145細胞在油菜花粉提取物（濃度為1000ug/mL）處理48h后，G0/G1期比例上升，分別為67.33%和68.15%。S期、G2-M期比例下降，PC-3分別下降16.66%和16.01%，DU-145分別下降21.22%和10.63%。油菜花提取物可能通過調(diào)控各腫瘤周期來發(fā)揮其對各腫瘤細胞的生長抑制作用，其可通過阻止前列腺癌細胞在G0/G1期，抑制細胞增殖。

4 討 論

高增殖性是惡性腫瘤的重要生物學特性之一，也是臨床腫瘤患者死亡的主要原因。目前，對腫瘤生長抑制的研究已經(jīng)成為腫瘤治療學研究的主要內(nèi)容[1]。非激素依賴性前列腺癌（hormone refractory prostate cancer,HRPC）是前列腺癌發(fā)展的最后階段，除少數(shù)局限于前列腺包膜內(nèi)的早期前列腺癌患者可行根治性前列腺切除術外，患者往往死于激素非依賴性細胞的增殖擴散[2]。

本實驗應用CCK-8法檢測BPE對PC-3和DU-145細胞增殖的抑制作用。CCK-8是一種新型的活細胞計數(shù)試劑,可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析,與MTT等其它四唑鹽相比具有操作簡便、靈敏度高、可重復性好等優(yōu)點,已經(jīng)開始被廣泛應用[3]。研究結果表明，在一定范圍內(nèi)隨著BPE濃度的增加，其對PC-3和DU-145細胞增殖的抑制作用越明顯,呈典型的劑量依賴性，PC-3和DU-145細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為386μg/mL和545μg/mL，當濃度繼續(xù)升高時，對前列腺癌細胞的抑制率反而下降，具體的原因和機制，需進一步實驗和探討其原因和機制。

實驗結果證實，BPE對前列腺癌PC-3和DU-145細胞有明顯殺傷作用，電鏡攝片中可見BPE作用細胞后，線粒體腫脹變性，線粒體嵴消失，提示線粒體可能是BPE作用的靶細胞器之一。線粒體為細胞各種生命活動提供能量，線粒體參與細胞凋亡，在細胞凋亡過程中關鍵作用的Bcl-2家族蛋白分布在線粒體外膜，核膜和內(nèi)質網(wǎng)膜上，該家族成員通過操控線粒體膜間隙蛋白的釋放對細胞凋亡加以調(diào)控。BPE是否通過Bcl-2/Bax蛋白通路來調(diào)控細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖有待進一步研究證實。

流式細胞儀檢測結果顯示，BPE作用后兩株前列腺癌細胞大多被阻滯在G0/G1期，這說明BPE主要作用在DNA合成前期，為BPE與其他細胞周期特異性化療藥物聯(lián)合使用提供了理論依據(jù)，這一結果與石柱等[4]研究天花粉蛋白對小鼠前列腺癌細胞RM21的實驗結果類似。細胞周期調(diào)控異常是細胞癌變的重要機制之一，通過藥物對細胞周期干預或調(diào)控使腫瘤細胞周期停滯，避免腫瘤細胞進入有絲分裂期，從而可阻抑其進一步增殖，這也是治療腫瘤的有效手段之一。對BPE具體抗腫瘤機制及其安全有效地給藥方式深入研究，將為應用于臨床治療前列腺癌提供更多理論和實驗依據(jù)。

［1］耿國軍，姜杰，杜好信，等.苦參堿對肺腺癌細胞生長抑制的實驗研究［J］. 浙江中西醫(yī)結合雜志，2009,19（4）207-208.

［2］李濤,李世文,鄭新民, 等. 白藜蘆醇對人激素非依賴性前列腺癌PC-3 Survivin蛋白表達的影響［J］.武漢大學學報(醫(yī)學版),2009，（3）：337-340.

［3］Hsieh JL, Wu CL, Lee CH, et al. Hepatitis B virus X protein sensitizes hepatocellular carcinoma cells to cytolysis induced by E1B - deleted adenovirus through the disruption of p53 function［J］. Clin Cancer Res, 2003, 9 (1) : 338 - 345.

［4］石柱,單圣道,袁濤，等.天花粉蛋白誘導小鼠前列腺癌細胞RM-1凋亡的實驗研究［J］.中藥材，2009，32（2）:239-242.

Suppression Effect of Brassica Campestris Pollen Extract on the Growth of Prostate Cancer Cell in vitro

ZHUChihong,DULingbin,GAOYun,et al.Cancer Research Institute,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310003),China

Objective:To study the effects ofBrassica campestris pollen extract(BPE)on prostate cancer cell line in vitro. Methods:PC-3 and DU-145 cell line from prostate cancer were treated with various concentrations of BPE.Morphologic change was observed with light microscope and apoptosis change by electron microscope.The suppression rate of the growth of prostate cancer cell was evaluated by using CCK-8 assay.Changes in prostate cancer cell cycle were observed by FAC SCailibur.Result:The growth of prostate cancer cells were markedly inhibited after being treated with BPE.After the treatment,obvious morphological change was observed;FCMshowed that the rate ofG0/G1 phase was increased and that the rate of S and G2-Mphase was decreased in the cell cycle.ConclusionBPE may have remarkable effect on inhibitingthe growth ofPC-3 and DU-145 cell line fromprostate cancer.

Brassica campestris pollen extract prostate cancer cell line growth suppression anti-tumo

浙江省科技攻關計劃項目（No.2005C33005）

曹明富E-mail:mfcao@hztc.edu.cn

2010-08-04