正交試驗(yàn)探討五靈膠囊配伍對慢性肝損傷小鼠的影響

瞿新紅， 王勝春， 皇甫娟， 田衛(wèi)斌

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，陜西西安710032)

中醫(yī)方劑，或中藥復(fù)方，是中醫(yī)用藥的主要形式與特色，因?yàn)樗侵嗅t(yī)辨證施治的具體體現(xiàn)和實(shí)施方式，因而復(fù)方中藥配伍理論是中醫(yī)藥理論的基礎(chǔ)［1-2］，開展方劑配伍規(guī)律的現(xiàn)代研究對于繼承和發(fā)展中藥配伍理論發(fā)揮臨床價(jià)值有著重要意義［3-4］，也能更有效地指導(dǎo)臨床，為中藥新藥研制提供依據(jù)。五靈膠囊(國藥準(zhǔn)字Z20090068)是由五味子、丹參、柴胡、靈芝制成的復(fù)方制劑，具有疏肝、益脾、活血功能，用于肝郁脾虛狹瘀癥，臨床用于乙型慢性肝炎治療［5-7］。處方來源于經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用33年。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)對五靈膠囊不同配伍進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，從藥效學(xué)方面探討五靈膠囊配伍的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 藥材:柴胡Bupleurum chinense DC(陜西白水產(chǎn))，北五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill(河北承德產(chǎn))，丹參Salvia miltiorrhiza Bge(陜西商洛產(chǎn))，靈芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst(河南蘆氏栽培品種)。試劑:膽堿酯酶(CHE)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(北京中生公司);丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。動(dòng)物:昆明種小白鼠，♂性，體重(20±2)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SC×K(軍)2002-05;儀器:半自動(dòng)生化儀(MD-100型)。

1.2 方法 取昆明小鼠170只，隨機(jī)分為17組，置溫度(25±1)℃，相對濕度(40% ～65%)的實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)環(huán)境3 d后試驗(yàn)。正常組小鼠皮下注射生理鹽水2 mL/kg，其余各組小鼠皮下注射20%CCl4香油溶液2 mL/kg，每3 d注射1次。第3次注射后，正常、模型組灌胃蒸餾水10 mL/kg，其余各組分別給予相應(yīng)受試藥物，給藥劑量均相當(dāng)于生藥10 g/kg，連續(xù)給藥10 d，同時(shí)各實(shí)驗(yàn)組小鼠每3 d繼續(xù)皮下注射20%CCl4香油溶液2 mL/kg，正常組小鼠皮下注射生理鹽水。末次給藥后，禁食過夜，眼眶取血，離心，取血清測定ALT;取肝組織用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗，置冰浴中勻化制得10%的肝勻漿，4℃12 000 r/min離心20 min，取上清測定MDA、CHE。

2 結(jié)果及分析

2.1 正交設(shè)計(jì) 選藥物五味子(A)、丹參(B)、柴胡(C)、靈芝(D)為交互配伍的主要因素，對上述因素各取2水平，選用藥為(1)，不選用藥為(2)，因素水平安排見表1。

2.2 正交設(shè)計(jì)與結(jié)果 按正交表L16(215)安排試驗(yàn)，取處方量五味子、丹參、柴胡、靈芝交互配伍，加10倍量乙醇回流2次，每次1 h，濾過，合并2次濾液，回收乙醇，減壓濃縮成稠膏。按上述1.2項(xiàng)方法進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果見表2～3。

表1 因素水平

2.3 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠MDA影響結(jié)果分析 本試驗(yàn)中并未設(shè)置誤差項(xiàng)，故將S值最小的因素B作為誤差項(xiàng)，結(jié)果另外14組因素全部顯著，提示正交試驗(yàn)沒有意義。隨后合并S值較小的4項(xiàng)B、C、BD、ABD作為誤差項(xiàng)，其自由度為4，以F值檢驗(yàn)作為判斷指標(biāo)，除配伍組A(五味子)和ABC(五味子+丹參+柴胡)無顯著性，其它配伍組均顯著或高度顯著。由于本試驗(yàn)要求各試驗(yàn)組有降低慢性肝損傷小鼠MDA的作用，故要求K1＜K2，即R值為負(fù)數(shù)有降低MDA作用，且負(fù)值越大效果越好。實(shí)驗(yàn)組 D、AD、CD、ACD、BCD、ABCD 的R值為負(fù)，說明單味靈芝，五味子+靈芝，柴胡+靈芝，五味子+柴胡+靈芝，丹參+柴胡+靈芝及全方能降低慢性肝損傷小鼠肝組織MDA值，其降MDA作用順序?yàn)镃D＞D＞BCD＞AD＞ABCD＞ACD。其余4配伍組 AB、AC、BC、ABC的 R值為正，則沒有降MDA的作用，結(jié)果見表4。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n=10)U/L

表3 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠ALT、CHE、MDA的影響 (n=10)

表4 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝MDA的影響(方差分析)

2.4 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝ALT影響結(jié)果分析 合并S值較小的5項(xiàng)作為誤差項(xiàng)，其自由度為5，以F值檢驗(yàn)作為判斷指標(biāo)，除配伍組B(丹參)，BC(丹參+柴胡)無顯著性，其它配伍組均顯著或高度顯著。由于本試驗(yàn)要求各配伍組有降低慢性肝損傷小鼠ALT酶的作用，故要求K1＜K2，即R值為負(fù)數(shù)時(shí)有效，且負(fù)值越大降酶效果越好。而配伍組 A、B、C、ABC、ABCD得R值為負(fù)，說明這5組配伍均有降低ALT酶的作用，但配伍組B(丹參)無顯著性，故丹參對降低小鼠ALT酶作用不顯著，其余4配伍組降A(chǔ)LT酶的作用順序?yàn)锳 ＞ABC ＞ ABCD ＞ C。另外，配伍組AC、BC、D、ACD、BCD的R值為正，說明這5組配伍升高小鼠肝ALT值，結(jié)果見表5。

表5 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝ALT酶的影響(方差分析)

2.5 藥物不同配伍對CCl4所致小鼠慢性肝損傷CHE影響的結(jié)果分析 合并S值較小的5項(xiàng)作為誤差項(xiàng)，以F值檢驗(yàn)作為判斷指標(biāo)，除配伍組AB(五味子+丹參)無顯著性，其余配伍組均高度顯著。由于本試驗(yàn)要求各配伍組有升高慢性肝損傷小鼠CHE酶的作用，故要求K1＞K2，即R值為正顯示有效，且正值愈大藥效作用愈強(qiáng)，故只有配伍組A、B、CD、BCD、ABCD能升高慢性肝損傷小鼠 CHE酶，其作用順序?yàn)锳＞ABCD＞BCD ＞B＞CD，其余配伍組C、BC、AD、ABD的R值為負(fù)，說明這4組配伍降低慢性肝損傷小鼠CHE酶，結(jié)果見表6。

表6 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝CHE酶的影響(方差分析)

2.6 驗(yàn)證 取小鼠50只，分為正常組、模型組、配伍BC組、配伍ABC組和全方組，每組10只，小鼠按上述1.2項(xiàng)下試驗(yàn)方法制備慢性肝損傷模型，各試驗(yàn)組給藥方法及劑量同上。結(jié)果:與正常組比較，模型組ALT與MDA顯著升高，CHE顯著降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。與模型組比較，配伍BC組明顯降低ALT，顯著升高CHE(P ＜ 0.01，P ＜0.05);配伍ABC組顯著降低ALT，升高CHE與MDA;全方組顯著降低ALT與MDA，升高CHE(P ＜0.01，P＜0.05)，見表7。

3 討論

采用正交設(shè)計(jì)法研究五靈膠囊各組分交互配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠MDA、ALT和CHE酶水平的影響，旨在明確4種組分交互配伍后藥效作用的意義和組方合理性。本試驗(yàn)中五味子、丹參、柴胡、靈芝是交互配伍的主要因素，按L16(215)正交列表安排試驗(yàn)，同一提取條件和給藥劑量，測定指標(biāo)為血清ALT酶水平與肝勻漿MDA值和CHE酶水平，每一試驗(yàn)組受試慢性肝損傷小鼠10只，采用數(shù)據(jù)取均值，15組配伍方測定結(jié)果以F值檢驗(yàn)［8-9］顯著性差異(P ＜0.01，P ＜0.05)。CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝組織MDA增加、ALT酶水平升高和CHE酶水平下降，能夠清除MDA、降A(chǔ)LT酶或升高CHE酶水平的因素為有效因素。就MDA和ALT而言即R值為負(fù)且負(fù)值愈大，清除自由基和降酶效果愈好，反之則沒有作用;而CHE酶的R值偏向正數(shù)愈大，說明肝功能修復(fù)作用愈強(qiáng)。試驗(yàn)分析結(jié)果顯示:因素D有清除慢性肝損傷小鼠肝組織自由基作用(P＜0.01)，而因素A(五味子)與因素C則無此作用，但當(dāng)靈芝配伍五味子或柴胡，能增強(qiáng)五味子和柴胡清除肝組織自由基的作用;五味子配伍丹參、柴胡無清除肝自由基作用;丹參+柴胡，五味子+丹參+柴胡也沒有降低MDA的作用，因?yàn)檫@5配伍組的R值為正，丹參+柴胡+靈芝和全方有顯著降MDA作用。慢性肝損傷小鼠肝細(xì)胞壞死導(dǎo)致ALT明顯升高，五味子、柴胡對慢性肝損傷小鼠血清ALT酶有明顯降低作用(P＜0.05)，但二者配伍后五味子+柴胡降A(chǔ)LT酶作用顯著減弱;靈芝無降低慢性肝損傷小鼠血清ALT酶作用，丹參有較弱的降低ALT酶作用;全方和五味子+丹參+柴胡配伍組有明顯降低ALT酶。慢性肝損傷小鼠肝細(xì)胞壞死導(dǎo)致肝功能下降，其肝臟合成功能標(biāo)志酶CHE降低，CHE合成增加意味著肝臟功能改善。五味子、丹參有升高CHE酶的作用(P ＜0.01)，但二者配伍后反而無升高CHE酶作用;柴胡、靈芝無增加CHE合成作用，柴胡 +靈芝配伍能顯著升高 CHE酶(P ＜0.01);五味子+丹參+靈芝配伍組無升高CHE酶作用，而全方和丹參+柴胡+靈芝配伍組均能升高CHE酶(P ＜0.01)。驗(yàn)證結(jié)果顯示:配伍BC組可降低ALT，升高CHE;配伍ABC組顯著降低ALT，升高CHE與 MDA;全方組降低 ALT與 MDA，升高CHE，與正交試驗(yàn)結(jié)果趨勢一致。在此實(shí)驗(yàn)條件下五靈膠囊配伍是合理的，綜合分析相對最佳因素為全方，既降低MDA與ALT酶活性，又增加CHE酶活性。

表7 各配伍組對CCl4所致小鼠慢性肝損傷酶活性的影響 (±s，n=4)

表7 各配伍組對CCl4所致小鼠慢性肝損傷酶活性的影響 (±s，n=4)

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量/(g/kg)血清ALT/(U/L)肝勻漿CHE/(U/L) MDA 值正常組 10 mL 7.15±2.11** 89.76±11.3** 94.98±10.37*模型組 10 mL 39.39±10.60 30.00±9.35 128.50±21.07 BC組 10 g 25.81±8.67* 101.40±19.20** 133.20±41.89 ABC組 10 g 12.38±7.49** 70.49±24.16** 162.50±31.58*全方組 10 g 10.90±2.66** 61.75±36.85** 71.15±8.73**

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