一種改進(jìn)的非人靈長類神經(jīng)功能缺損評價方法

朱 華，盧 珊，馮 銘，李 秦，劉 穎，代小偉，安沂華，趙春華，王任直，秦 川

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，

國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所motac合作實驗室，北京 100050；

3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，北京 1000730；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100005；5.北京神經(jīng)外科研究所，北京 100050)

動物模型是研究腦血管疾病損傷機(jī)制和防治措施必不可少的工具。評價量表在監(jiān)測臨床腦卒中病情變化、療效判斷、預(yù)測結(jié)局及大樣本臨床試驗研究中起重要作用。目前為止國際上尚無一個公認(rèn)的可用于多中心臨床研究的腦卒中評定量表，與之相關(guān)的靈長類腦卒中動物模型及神經(jīng)行為評價方法更是缺乏，嚴(yán)重影響了臨床科研資料的可比性。針對這個問題，在進(jìn)行食蟹猴腦出血模型制作及干細(xì)胞治療的研究過程中，我們對目前靈長類腦卒中模型評價中常用的KITO［1］量表進(jìn)行修改和細(xì)化后對實驗猴的神經(jīng)功能進(jìn)行了動態(tài)量化觀察，使其更適于靈長類腦卒中神經(jīng)功能缺損的評價。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年雄性食蟹猴12只，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，年齡4～6歲，體重4.2～4.5kg。

1.2 腦出血模型的制作

使用自體股動脈抗凝血腦內(nèi)注射方法建立腦出血模型，見參考文獻(xiàn)［2］

1.3 干細(xì)胞治療

1.3.1 動物分組：12只動物分為模型對照組、高劑量組、低劑量組，分組的原則是各組動物間體重沒有顯著性差異。各組劑量見下表。

1.3.2 細(xì)胞注射：細(xì)胞為250μL的無色懸液，2個移植途徑，每個移植路徑分3個點(diǎn)注射，每點(diǎn)移植量為40μL，細(xì)胞數(shù)約6.7×105，移植速度10μL/min。對照組：等體積生理鹽水。

1.4 神經(jīng)功能評分

原始評價量表來源于文獻(xiàn)1，在原表格基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)化修改。其中意識28分，感覺系統(tǒng)22分，運(yùn)動系統(tǒng)32分，骨骼肌共濟(jì)協(xié)調(diào)18分共100分。造模后6h，1d，3d，1w及干細(xì)胞注射后1d，3d，1w，2w，3w，4w在每天的固定時間使用文獻(xiàn)中的表格和改進(jìn)的表格同時進(jìn)行評分。表中的“威逼”刺激特指使用鈍頭鋼條輕輕接觸或試圖接觸動物。沒有任何捅、刺、扎、撥、挑等的強(qiáng)制外力施加于動物。聲音刺激特指使用鈍頭鋼條輕輕敲擊動物籠具發(fā)出的70db左右的金屬碰撞聲。接觸刺激特指使用毛刷輕輕接觸動物肌膚。除輕微的掃刷力量外，沒有其他任何強(qiáng)制外力施加于動物。所有評分由同一名有經(jīng)驗的評價者完成。

表1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療食蟹猴腦出血實驗分組Tab.1 The grouping of the animal

表2 改進(jìn)的神經(jīng)功能評價表Tab.2 The proved neurological deficit scale

續(xù)表

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計方法采用相關(guān)性分析，單因素方差分析，P＜0.05時認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

造模手術(shù)前，所有動物的行為表現(xiàn)均正常，神經(jīng)功能評分為0。造模手術(shù)后6h，動物在麻醉蘇醒后均出現(xiàn)了與血腫部位相對應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)定位體征。主要表現(xiàn)為有意識但情緒低落，對刺激不反抗。受到威逼刺激能夠行走，但攀爬困難。對腳趾疼痛有弱的、不完全的、不協(xié)調(diào)的收縮反應(yīng)。左前肢出現(xiàn)明顯的麻痹，失去運(yùn)動能力。用修改前后的表格評分均為31分左右。但從術(shù)后24h開始出現(xiàn)評分上的差異。隨著時間的推移這種差異更加明顯。干細(xì)胞注射前將動物進(jìn)行隨機(jī)分組后，用原表格評價的分?jǐn)?shù)各組之間雖然沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，但低劑量組的分?jǐn)?shù)比高劑量組和模型組低且標(biāo)準(zhǔn)差較大。改進(jìn)表格統(tǒng)計的數(shù)據(jù)較平均，因此在注射干細(xì)胞后采用改進(jìn)的表格進(jìn)行評分。結(jié)果顯示干細(xì)胞注射后1周開始到動物被安樂時，劑量組與對照組之間的神經(jīng)功能評分出現(xiàn)顯著性差異(p＜0.05)。高、低劑量組間未見顯著性差異。

3 討論

腦卒中臨床神經(jīng)功能缺損程度評分標(biāo)準(zhǔn)在治療預(yù)后評估方面有很好的參考價值。臨床醫(yī)師根據(jù)長期臨床經(jīng)驗，提出好的腦卒中評定量表應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)［3］：1、量表應(yīng)包括足夠的神經(jīng)功能缺損評定項目，而且包含的項目對結(jié)局有預(yù)測性；2、量表的重測信度和評定者間信度好，內(nèi)部一致性好；3、量表應(yīng)敏感，評分要覆蓋神經(jīng)功能缺損的整個范圍；4、使用方便，使用者易掌握，整個評定時間最好不超過14min。為了評分的可信性應(yīng)該只包括定義明確、容易評分的項目；但為保持量表整體的敏感性，量表中應(yīng)包括能體現(xiàn)各種腦卒中類型的項目。這兩者之間就存在著矛盾。所以在制訂腦卒中評定量表時應(yīng)全面考慮綜合分析。雖然靈長類動物大腦的構(gòu)筑、白質(zhì)與灰質(zhì)的比值及微血管網(wǎng)絡(luò)的分布區(qū)域與人類似，但種系發(fā)生上的差異使評價靈長類動物的神經(jīng)功能缺損不能簡單的平移臨床量表［4，5］?？蓽?zhǔn)確反映靈長類神經(jīng)功能缺損的量表必須根據(jù)靈長類動物的特點(diǎn)結(jié)合臨床指標(biāo)而設(shè)計［6］。我們之所以已Kito的表格為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)主要原因有以下幾點(diǎn)：1、評分表的格式采用的是臨床常用的glasgow昏迷評分，比較直觀。2、內(nèi)容設(shè)置比較全面合理：評分包含4各方面：意識、骨骼肌協(xié)調(diào)、感覺系統(tǒng)和運(yùn)動系統(tǒng)。其中前3項既與臨床相關(guān)，是臨床評分表格中的必備項目，又體現(xiàn)了動物野外生存應(yīng)對外界危機(jī)各種刺激的反應(yīng)能力。在運(yùn)動功能的檢查項目中，首先是將前后肢分開進(jìn)行評價，因為猴的前肢功能在進(jìn)化過程中基本獨(dú)立出來，主要用于抓握和攀爬等，前肢功能損傷會嚴(yán)重降低動物的野外生存能力。另外在每個分項目均有反映肢體麻痹的內(nèi)容，并把左右前肢分開評價。我們的實驗也證實造模手術(shù)主要影響動物對側(cè)上肢的感覺運(yùn)動功能，同側(cè)則幾乎不受影響。因而把左右前肢分開評價非常必要。

表3 造模及干細(xì)胞治療前后神經(jīng)功能評分結(jié)果Tab.3 Neurological deficit score after stroke and human mesenchymal stem cell transplantation

感覺和反射功能在神經(jīng)功能評價中占有很重要的地位，但往往因為無法準(zhǔn)確檢查而不被包括在檢查項目中。原表格中雖然對深淺感覺和各項反射功能進(jìn)行了列項，但評價標(biāo)準(zhǔn)比較模糊，而且每個條目之間分差較大，當(dāng)動物癥狀不明顯時量表的敏感性減低。即損傷程度越輕，改進(jìn)表格與原表評分結(jié)果之間的差異越顯著。我們的評分結(jié)果也證實了這一點(diǎn)：術(shù)后3d即癥狀最嚴(yán)重的時期，兩個評分表間的差異不顯著。從術(shù)后7 d開始兩種評分方法出現(xiàn)了統(tǒng)計學(xué)上的差異。

改進(jìn)的表格對原表格所列條目進(jìn)行了逐級細(xì)化；對給與動物的刺激進(jìn)行分類并對每種刺激明確定義，使評價者易于掌握和準(zhǔn)確打分。這樣即使是神經(jīng)功能的細(xì)微恢復(fù)(如由表現(xiàn)為手指抓握時持續(xù)翹趾的中度痙攣和無力到偶爾翹趾的輕度痙攣和無力)也能表現(xiàn)出來。而正是這些細(xì)微功能對于動物的整體神經(jīng)功能恢復(fù)評價具有重要作用。

靈長類腦卒中模型能較好的模擬人類腦血管疾病，但因涉及動物倫理、實驗成本等原因使用較少，更缺乏標(biāo)準(zhǔn)的模型制作方法和神經(jīng)功能評價方法。改進(jìn)的量表在原表格包括運(yùn)動、感覺和反射功能等信息的基礎(chǔ)上，對原有條目進(jìn)行細(xì)化和規(guī)范，克服了舊表格中分差大，評價標(biāo)準(zhǔn)模糊的缺點(diǎn)，即使動物的行為學(xué)癥狀不明顯時也能評價出差異，使量表的敏感性大為提高。改進(jìn)的量表可信度增高、可實施性增強(qiáng)，具有良好的臨床相似性和可操作性。為建立標(biāo)準(zhǔn)化神經(jīng)功能功能評價量表進(jìn)行了有益嘗試。

［1］Kito G，Nishimura A， Susumu T， et a1. Experimental thromboembolic stroke in cynomolgus monkey［J］.J Neurosci Methods，2001，105(1)：45-53.

［2］朱華，李秦，馮銘，等.食蟹猴腦出血模型的建立及評價［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志.2009，19(7)，29-32.

［3］Hantson L，DeWeerdt W，DeKeyser J，et al.The European stroke Scale［J］.Stroke，1994，25：2215-2219.

［4］Ben R，Naimath K，Eray T，et a1.Chronic ischemic stroke model in cynomolgus monkeys：behavioral，neuroimaging and anatomical study［J］.Neurol Res，2003，25(1)：68-78.

［5］Marshall JW，Ridley RM.Assessment of cognitive and motor deficits in a marmoset model of stroke［J］.ILAR J，2003，44(2)：153-160.

［6］Marshall JW，Ridley RM.Assessment of functional impairment following permanent middle cerebral artery occlusion in a nonhuman primate species［J］.Neurodegeneration，1996，5(3)：275-286.