環(huán)孢素A對異種脫細胞神經(jīng)移植的影響

肖紅喜，胡 敏，李 妍，牛 宇

(1.解放軍第309醫(yī)院口腔科，北京 100091；2.解放軍總醫(yī)院口腔科，北京 100853；3.遼寧省遼河油田第二醫(yī)院口腔科，盤錦 124012)

面神經(jīng)損傷是口腔頜面外科常見的疾病，臨床修復(fù)尤感棘手。近年來，脫細胞異種神經(jīng)移植成為一種可供選擇的方法，其在動物實驗方面取得了顯著的效果。雖然周圍神經(jīng)脫掉施萬細胞、外膜及束膜等成分之后，只剩有細胞外基質(zhì)成分，其免疫原性在同種動物之間是微弱可以忽略的。但異種間周圍神經(jīng)基質(zhì)移植是否存在免疫排斥反應(yīng)，以及免疫抑制劑對脫細胞異種面神經(jīng)移植是否有效相關(guān)文獻報導(dǎo)很少。本實驗旨在探討異種脫細胞面神經(jīng)移植過程中環(huán)孢素A的作用。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

48只成年、健康的W istar雌性大鼠，體重180～210g［解放軍總醫(yī)院實驗動物中心(京)2007-0004］。隨機分為4組，每組12只。A組，異種面神經(jīng)移植組；B組，異種面神經(jīng)移植應(yīng)用CSA免疫抑制劑組；C組，脫細胞異種面神經(jīng)移植組；D組，脫細胞異種面神經(jīng)移植應(yīng)用CSA免疫抑制劑組。6只成年、雌性新西蘭大白兔作為供體，雙側(cè)面神經(jīng)在無菌條件下取出，一部分無菌條件下保存，另一部分經(jīng)深低溫冰箱保存的兔面神經(jīng)條，生理鹽水室溫下復(fù)融，清除神經(jīng)干表面疏松的纖維組織及脂肪組織，至較為堅硬光滑的神經(jīng)外膜，生理鹽水反復(fù)沖洗神經(jīng)3次。按下述步驟進行化學(xué)處理：(1)蒸溜水浸浴12h；(2)3%Triton X-100溶液浸浴12h；(3)蒸餾水浸浴3h；(4)4%脫氧膽酸鈉溶液中浸浴12h；(5)重復(fù)上述步驟；(6)蒸餾水浸浴3h；(7)取出萃取后的神經(jīng)，外觀呈乳白色，略通透。放入無菌PBS溶液(pH 7.2)中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2 實驗方法

用1%戊巴比妥鈉麻醉后(60mg/kg)，在實驗鼠一側(cè)耳屏前及頜后做切口，翻瓣暴露面神經(jīng)各分支。在頰支上用無菌剃須刀整齊切斷并切除神經(jīng)干約1.0cm。然后選用相應(yīng)粗細的兔異種面神經(jīng)或兔脫細胞異種面神經(jīng)1.0cm，于4倍手術(shù)放大鏡下用10-0尼龍線縫合神經(jīng)外膜4～6針［3］。術(shù)后給予相應(yīng)的藥物。CSA膠囊(瑞士諾華制藥有限公司，25mg/粒)，生理鹽水稀釋后制備成懸濁液，5mg/(kg·d)，應(yīng)用灌胃針根據(jù)分組對動物進行灌胃治療，時間為5周。

1.3 電生理檢測

移植術(shù)后5周和12周，各組取6只大鼠，在麻醉狀態(tài)下循原切口切開皮膚顯露雙側(cè)面神經(jīng)頰支和對應(yīng)之口輪匝肌，刺激電極置于縫合口近心端在移植物的上端安放刺激電極，以方波刺激該神經(jīng)，在該移植物的下端安放記錄電極以記錄該神經(jīng)的動作電位，經(jīng)肌電圖儀記錄儀描記后比較其神經(jīng)傳導(dǎo)速度的變化。

1.4 染色方法

各組分別于術(shù)后5周與12周處死6只實驗動物，取移植段面神經(jīng)，行組織學(xué)觀察。部分標(biāo)本10%福爾馬林液中固定24h后，于移植段近心端0.2cm處、移植段中點及移植段遠端0.2cm處，行橫斷面與縱斷面5μm切片，HE染色和 Masson三色染色。另外部分標(biāo)本3%戊二醛固定24h，樹脂包埋后行超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)。用HITACHI透射電鏡400倍下應(yīng)用MPLAS 500彩色多媒體病理圖文分析系統(tǒng)，每片拍6張不同視野，計數(shù)橫斷面軸突數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用STATA7.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。處理所有計量資料，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察

5周時，A、B組切片均頻繁出現(xiàn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的破壞。軸突水腫明顯，神經(jīng)纖維粗細不均，呈脫髓鞘改變，有大量淋巴細胞浸潤，偶見再生神經(jīng)纖維。神經(jīng)纖維密度顯著降低。而C、D組可見大量再生神經(jīng)纖維。12周時，A、B組仍呈現(xiàn)崩解片段，大量淋巴細胞浸潤，B組可見少量再生神經(jīng)纖維(彩插1圖1，2)。C、D組有髓神經(jīng)纖維排列整齊，軸突僅見輕微水腫，發(fā)育良好，密度同正常神經(jīng)相似。可見大量新生血管，幾乎無瓦勒氏變性及炎性細胞浸潤(彩插1圖3，4)。

2.2 電鏡觀察

術(shù)后5周，各組神經(jīng)再生單位形成均不明顯。術(shù)后12周，B、C、D組中基膜管中均可見明顯神經(jīng)再生單位。C、D兩側(cè)神經(jīng)纖維的直徑以及髓鞘厚度無明顯差異，髓鞘電子密度均勻，細胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與游離核糖體均較豐富(彩插1圖5，6)。

2.3 軸突計數(shù)

5周和12周時，C，D組面神經(jīng)頰支神經(jīng)再生軸突數(shù)均高于A，B組(P＜0.05)，5周時，A，B組面神經(jīng)頰支神經(jīng)再生軸突數(shù)無顯著差異，而12周時，B組再生軸突數(shù)明顯高于A組(P＜0.05).

表1 面神經(jīng)頰支軸突數(shù)目Tab.1 The number of nerve axonals

表2 面神經(jīng)頰支傳導(dǎo)速度的比較(m/s，n=6)Tab.2 Comparision of conduction velocity between the bucal branches of facial nerve(m/s，n=6)

2.4 電生理測試結(jié)果

在移植段近側(cè)的正常神經(jīng)上給予電刺激時，可以在口輪匝肌上記錄到誘發(fā)的運動神經(jīng)傳導(dǎo)電位。復(fù)合動作電位測試表明，再生神經(jīng)已經(jīng)重建對頰支面肌運動的支配。不同時間段各組面神經(jīng)頰支傳導(dǎo)速度的比較見下表(表2)，可見術(shù)后5周和12周，D組面神經(jīng)頰支傳導(dǎo)速度均高于其它組(P＜0.05).

3 討論

施萬細胞是外周神經(jīng)中最基本的免疫組成部分，周圍神經(jīng)脫掉施萬細胞、外膜及束膜等成分之后，只剩有細胞外基質(zhì)成分，其免疫原性在同種動物之間是微弱可以忽略的。組織工程化的脫細胞同種異體神經(jīng)移植物，組織相容性好，排斥反應(yīng)小，有較強引導(dǎo)神經(jīng)再生的作用，已被較多的同種異體移植的研究所證明?；瘜W(xué)去細胞異體神經(jīng)移植修復(fù)周圍神經(jīng)缺損已經(jīng)用于臨床，且恢復(fù)效果較好，說明去細胞異體神經(jīng)有著良好的應(yīng)用前景［1］。為了便于臨床應(yīng)用，克服人體周圍神經(jīng)脫細胞移植物來源的困難，有人初步試驗了兔與大鼠的異種間移植，取得了與同種異體間移植類似的促進受損神經(jīng)再生的效果［3］。目前還沒能異種脫細胞面神經(jīng)移植的文獻報道。

CSA作為免疫抑制劑在器官移植領(lǐng)域已得到較為廣泛的應(yīng)用，但長期應(yīng)用 CSA會導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥［4］。在脫細胞異種或異體神經(jīng)移植中，短期應(yīng)用CSA，可以保證神經(jīng)軸突順利通過橋接物，妨止橋接物在神經(jīng)軸突接頭之前因排斥反應(yīng)而吸收，從而導(dǎo)致神經(jīng)移植失敗。劉世清認(rèn)為CSA在異體神經(jīng)移植中有效地起到了抗免疫排斥作用，其作用效果同療程在一定劑量范圍內(nèi)呈正相關(guān)并存在一劑量臨界值，超過該值后神經(jīng)再生的療效并不增加，并認(rèn)為 5周是抗免疫排斥的最短有效時間［5］。Brenner等［6］研究了不同時間截點 CSA對神經(jīng)移植的作用，認(rèn)為40d和70d時，實驗結(jié)果無顯著差異。Kuo［7］等認(rèn)為在小型豬面部部分組織移植中，CSA可以使免疫排斥反應(yīng)延遲38到49 d。本實驗觀察了5周和12周時神經(jīng)移植后的變化，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用免疫抑制劑組兩個時間點結(jié)果無顯著差異，說明當(dāng)再生神經(jīng)纖維軸突通過橋接物后，可以不再使用免疫抑制劑。應(yīng)用免疫抑制劑組在兩個時間點的再生軸突數(shù)和面神經(jīng)頰支傳導(dǎo)速度均高于其它組，說明免疫抑制劑在一定程度上克服了神經(jīng)細胞外基質(zhì)成分的排斥反應(yīng)，但去除免疫抑制劑后神經(jīng)活性功能需長期觀察。

［1］劉洪飛，胡敏，劉洪臣，等.同種異體神經(jīng)行面神經(jīng)缺損修復(fù)的初步應(yīng)用［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2007，23(6)：659-661

［2］王旭，陳學(xué)英，殷少芳，等.去細胞神經(jīng)移植后再生神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的觀察［J］.電子顯微學(xué)報，2009，28(3)：267-270

［3］張旭，才艷紅，賈樺，等.異種神經(jīng)脫細胞移植物修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的實驗研究［J］.解剖科學(xué)進展，2007，13(1)：46-48

［4］Trififio S，Borensztajn J，Mehta J.Therapeutic cyclosporine (CSA) monitoring after allogenic hematopoietic stem cell transplantation(HSCT)：high-performance liquid chromatography (HPLC) or TDX［J］? Biology of Blood and Marrow Transplantation，2004：10(suppl 1)：103

［5］劉世清，李皓桓，彭昊，等.同種異體神經(jīng)移植中環(huán)孢素 A的最短有效時間［J］.武漢大學(xué)學(xué)報，2002，23(2)：163-165

［6］Brenner MJ，Moradzadeh A，Myckatyn TM，et al.Role of timing in assessment of nerve regeneration［J］.Microsurgery，2008，28(4)：265-272

［7］Kuo YR，Shih HS，Lin CC，et al.Swine hemi-facial composite tissue allotransplantation：a model to study immune rejection［J］.J Surg Res.2009，153(2)：268-273.