轉基因DT40細胞導入早期雞胚后的分布及綠色熒光蛋白表達的研究

孫 鵬，趙 晨，燕 麗，靳文靜，張文新，李贊東

(1.中國農業(yè)大學生物學院農業(yè)生物技術國家重點實驗室，北京 100193；2.北京教育考試院，北京 100083)

隨著重組DNA技術的迅猛發(fā)展，動物轉基因技術的研究取得了一系列可喜的進展。這種基因轉移技術為人類提供了從遺傳上改變高等動物細胞的能力，并成為制備轉基因動物和進行基因治療的基礎。把經基因改造的細胞移植到動物體內將可能為生產藥用蛋白［1］或者進行基因治療［2］提供一種更加經濟的途徑。但是，對于許多高等動物，特別是具有完善的免疫系統(tǒng)的脊椎動物，基因傳遞系統(tǒng)存在潛在的免疫刺激性，異源基因的表達容易引起宿主產生免疫應答，進而將降低異源基因表達產物的量甚至將其完全消除［1，3-5］。Mohammed等［1］將重組的人免疫球蛋白(rh IgG3)基因轉入雞法氏囊淋巴細胞系(DT40)后再將后者通過靜脈注射到產蛋母雞體內，在注射細胞6d后宿主雞所產蛋中可通過ELISA檢測到rh IgG3，該蛋白含量在注射12d后的蛋中達到最高峰，但在此之后驟然下降，這可能是宿主對 rh IgG3產生了免疫應答的結果。要解決這一問題，需要使宿主動物對異源蛋白形成免疫耐受。根據 Burnet提出的抗體產生克隆選擇學說［6］，有研究人員在雞胚發(fā)育早期將異源蛋白注射到胚胎內，可以誘導出生后的雞對此抗原的免疫耐受［7］。

禽類的胚胎發(fā)育模式與哺乳動物存在很大差異，前者的胚胎發(fā)育是在離開母體的密閉蛋殼內獨立完成的，可以在不停止胚胎發(fā)育的情況下對其進行研究，這使得胚胎血管微注射外源物質的方法成為對禽類進行研究的一種重要手段［8-11］。本實驗室曾在胚胎早期注射異種蛋白誘導雞免疫耐受方面進行過一系列的研究［12］，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育過程中持續(xù)導入外源蛋白比較困難，一次性大劑量的接種外源蛋白可能會導致受體胚胎大量死亡。將攜帶異源基因的細胞導入早期發(fā)育的胚胎中，若導入細胞可以存活且目的基因能夠正常持續(xù)表達，則可能解決這一問題。

本實驗的目的是通過血管微注射法將表達異源蛋白的細胞導入早期雞胚，研究供體細胞在雞胚中的分布以及所攜帶的外源基因的表達情況，為胚胎期導入外源蛋白誘導免疫耐受的研究以及將轉基因細胞移植到動物體內生產目的蛋白的研究提供科學依據和技術平臺。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗動物：本實驗所用白萊航雞(White Leghorn，Gallus domesticus)種蛋購自中國農業(yè)大學動物科技學院養(yǎng)雞場。

1.1.2 細胞及載體：雞法氏囊淋巴細胞系(DT40)由韓國首爾國立大學 Han Jae Yong教授贈送。pEGFP-N1載體由軍事醫(yī)學科學院范寶興博士贈送。

1.1.3 主要試劑及材料：限制性內切酶Eco O109Ⅰ購自MBI公司；限制性內切酶Hin dⅢ購自NEB公司；DMEM/F-121∶1、雙抗、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、非必需氨基酸和丙酮酸鈉均購自HyClone公司；G418購自Sigma公司；PCR預混液購自寶生物工程大連有限公司；膠回收試劑盒購自北京 Tiangen生物技術有限公司；Southern雜交膜(Amersham-XL尼龍膜)購自 GE公司；放射性同位素α-32p-dCTP購自中國同位素進出口公司；X光片購自Kodak公司；顯影濃縮液及定影濃縮液購自樂凱公司；PCR引物的合成由上海英駿生物技術有限公司完成；一抗：小鼠抗綠色熒光蛋白(GFP)單克隆抗體購自MBL公司；生物素化羊抗小鼠IgG二抗試劑盒、聯(lián)苯二胺(DAB)顯色試劑盒及小鼠抗增殖細胞 核 抗 原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.1.4 主要設備：電擊儀：Gene Pulser X CellTMElectroporation System(Bio-Rad USA)；倒置熒光顯微鏡：IX71(Olympus Japan)；纖維光源 (Nikon Japan)；雜交爐(Bio-Rad USA)；拉針儀：PN-40(Narishige Japan)；切片機(Leica Germany)。

1.2 實驗方法

1.2.1 DT40細胞的轉染與篩選：將 DT40細胞懸浮培養(yǎng)于DMEM/F-12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%丙酮酸鈉，1%非必需氨基酸，100U/m L青霉素，100μg/mL鏈霉素)中置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37.5℃，5%CO2)。收集對數(shù)期生長的DT40細胞約5×106個與60μg線性化pEGFP-N1載體于無血清的DMEM/F-12基礎培養(yǎng)基中混勻后電擊轉染(550V，50μF)。電擊后的DT40細胞用DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h后添加 G418(終濃度為 1.5mg/m L)繼續(xù)培養(yǎng)7 d，在此期間，每2d更換一次含G418的培養(yǎng)基。之后換為含終濃度為0.4mg/m L的G418培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14d，在此期間，每2d更換一次含G418的培養(yǎng)基。收集細胞，將細胞按5～10個/孔的細胞密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，在終濃度為0.4mg/m L的G418培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察，21d后挑出由單個細胞形成的克隆，擴大培養(yǎng)，熒光顯微鏡鏡檢。選取將作為供體細胞的細胞株命名為DT40-GFP。

1.2.2 GFP基因的Southern blot檢測：以 pEGFPN1載體序列(GenBank Accession No.U55762)設計探針引物，上游5'-GGACGGCGACGTAAACGGCCACAA-3'，下游 5'-ACGAACTCCAGCAGGACCATG-3'，目的片段為GFP基因內長度為618bp的一段序列。提取DT40-GFP細胞的基因組 DNA，取30μg基因組DNA用Hin dⅢ，37℃過夜消化。將消化后的基因組DNA通過0.7%的瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉移到尼龍雜交膜上。通過隨機引物法將618bp的DNA探針用32P標記后，進行雜交，放射自顯影。

1.2.3 雞胚血管微注射 DT40-GFP細胞及熒光顯微鏡檢測：種蛋表面以新潔爾滅溶液擦洗干凈后置于孵化器中在38.5℃，相對濕度70%的條件下孵化，2h翻蛋一次，翻蛋角度為90°。將孵化65～70h(胚胎發(fā)育至17～18期［13］)的種蛋取出，用酒精棉擦拭表面消毒后，通過纖維光源照蛋確定胚胎所處位置并做標記。在記號附近的蛋殼上用醫(yī)用牙鉆開一個直徑約4mm的小窗。在實體顯微鏡下用外徑為50～70μm的玻璃針將2μL含有約6×104個DT40-GFP細胞的PBS(pH 7.6)緩慢注射到雞胚的前卵黃靜脈中，注射后用 parafilm封閉開口，標記，共注射117個雞胚。將處理后的胚胎放回孵化器繼續(xù)孵化，在孵化后4～19 d，每天取4～5個活胚，用鑷子將胚胎不同組織分開，置于玻璃平皿中，熒光顯微鏡下鏡檢，觀察熒光細胞在胚胎中的分布情況。取4只新生小雞，頸椎脫臼處死并解剖，取腦、心臟、卵黃囊膜、法氏囊等組織、器官，熒光顯微鏡下鏡檢，觀察熒光細胞在小雞各組織器官中的分布情況。

1.2.4 PCR檢測：在熒光顯微鏡下收集含有熒光細胞的胚胎組織樣品并提取基因組 DNA，方法同Taberlet and Bouvet的報道［14］。以 pEGFP-N1載體序列(GenBank Accession No.U55762)設計PCR引物：上游5'-TTCAAGGACGACGGCAACT-3'，下游5'-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT-3'擴增GFP基因內部的一段314bp大小的DNA片段。PCR擴增條件為94℃ 5m in，94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 30s，35個循環(huán)，72℃延伸10m in結束，1.5%瓊脂糖分析。

1.2.5 免疫組織化學檢測 GFP的表達：分別取孵化5d和10d的注射了 DT40-GFP細胞的雞胚組織，于10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。取組織蠟塊連續(xù)切片，厚度6μm，60℃烤片15m in，常規(guī)脫蠟至水，其余步驟嚴格按照生物素化羊抗小鼠IgG二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒說明書操作。一抗工作濃度為1：250，DAB顯色后，切片于顯微鏡下檢測。

2 結果

2.1 穩(wěn)定整合 GFP基因的DT40細胞株(DT40-GFP)的獲得與鑒定：電擊轉染后經G418篩選得到了多個DT40細胞株。經熒光顯微鏡檢測，在其中選擇GFP表達效果好，分裂周期較短的一株 DT40細胞(彩插3圖1A、B)作為雞胚血管微注射實驗的供體細胞，命名為DT40-GFP。Southern blot結果表明(彩插3圖1C)，GFP基因整合到了 DT40-GFP細胞基因組中，且拷貝數(shù)為1。

2.2 DT40-GFP細胞在雞胚中的分布及存活情況：在孵化4d(即注射后1d)至孵化19 d(出雛前)的胚胎中均可以檢測到熒光細胞。DT40-GFP細胞在胚胎中分布比較廣泛，在心臟(彩插4圖2H)、肝臟(彩插4圖2J)、脾臟(彩插4圖2K)、腎臟(彩插4圖2I)及腸(彩插4圖2F)等內臟器官上數(shù)量較少，胚胎頭部的熒光細胞數(shù)量較多，主要集中在腦部(彩插4圖2A、B、C、L)，在卵黃囊膜(彩插4圖2G)和尿囊膜(彩插4圖2D)上也相對較多。DT40-GFP細胞被導入胚胎后，細胞形狀發(fā)生了較大變化(彩插4圖2C、G)

2.3 DT40-GFP細胞在孵出小雞體內的分布及存活情況：將四只注射DT40-GFP細胞的新生小雞解剖后，在熒光顯微鏡下仔細觀察小雞的腦、心臟、卵黃囊膜、法氏囊及各內臟器官，均未檢測到熒光細胞。

2.4 DT40-GFP細胞在雞胚內的熒光檢測統(tǒng)計：本實驗共檢測了67只注射了DT40-GFP細胞的雞胚，在58只雞胚中檢測到了熒光細胞，占所檢測樣本的86.6%；共檢測4只胚胎期導入 DT40-GFP細胞后孵出的小雞，沒有檢測到熒光細胞，具體數(shù)據總結于表1。

表1 DT40-GFP細胞在受體中的熒光檢測結果Tab.1 Detection of DT40-GFP cells in recipients under fluorescence microscopy

2.5 體細胞轉基因嵌合體雞胚中 GFP基因的檢測：取孵化5d的嵌合體雞胚頭部和身體部分分別提取基因組DNA，取孵化10d、15d嵌合體胚胎的腦和心臟分別提取基因組DNA，共得到基因組樣品28份，通過PCR反應，全部能擴增出相應的DNA片段，而未注射的野生型胚胎基因組中沒有擴增出相應DNA片段，部分樣本的PCR擴增電泳結果見圖3。

圖3 PCR擴增注射DT40-GFP細胞受體組織基因組DNAFig.3 The PCR amplification of chimeric tissue genome DNA注：M.DNA marker；P.pEGFP-N1質粒(陽性對照)；N.未注射雞胚基因組樣本(陰性對照)；1～4.孵化5d嵌合體胚胎頭部基因組樣本；5～8.孵化5d嵌合體胚胎身體基因組樣本；9～11.孵化10d嵌合體胚胎腦部基因組樣本；12～14.孵化10d嵌合體胚胎心臟基因組樣本；15～17.孵化15d嵌合體胚胎腦部基因組樣本；18～20.孵化15d嵌合體胚胎心臟基因組樣本Note：Lane M：DNA size markers；Lanes 1-4：The head of four 5-day somatic chimeric chicken respectively.Lanes 5～8：The body of four 5-day somatic chimeric chicken respectively.Lanes 9～11：The head of three 10-day somatic chimeric chicken embryo respectively.Lanes 12～14：The body of three 10-day somatic chimeric chicken embryo respectively.Lanes 15～17：The head of three 15-day somatic chimeric chicken embryo respectively.Lanes 9～11：The body of three 15-day somatic chimeric chicken embryo respectively.Genomic DNA of a nonmanipulated chicken embryo and plasm idDNA(pEGFP-N1)were used as negative(lane N)and positive(lane P)control，respectively

2.6 體細胞轉基因嵌合體雞胚中GFP的檢測

通過免疫組化法，在雞胚的頭部、心臟、身體等部位檢測到了GFP陽性細胞，而在陰性對照組中沒有檢測到陽性信號，證明在熒光顯微鏡下觀察到的注射了DT40-GFP細胞的雞胚中的熒光細胞的確表達了GFP，部分樣本的免疫組化結果彩插3見圖4。

3 討論

3.1 胚胎血管微注射時期的選擇

禽類胚胎的發(fā)育與哺乳動物差別很大，禽受精卵產出體外時胚胎通常已發(fā)育至第Ⅹ期，即胚盤期，相當于哺乳動物的囊胚期。有一些研究［15-16］采用了將其他來源的供體細胞注入胚盤下腔的方法制備嵌合體禽類，也有使用這種方法制備轉基因嵌合體禽類［18-19］的報道。但經這種注射方法處理過的種蛋孵化率一般在20%～40%之間，得到后代的比例較低。本實驗室嘗試過在雞胚處于胚盤期時注射供體細胞的方法，由于胚盤下腔的空間小，只能容納少量的供體細胞，操作時針尖穿過胚盤下腔導致供體細胞流失的概率很大，并且發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育過程中大量供體細胞分散在胚外組織膜上，只有少量的供體細胞在胚體內部，不能滿足本實驗的要求。

在胚胎形成血管之后，此時，可以將外源細胞以血管微注射的方法導入胚胎中形成嵌合體［8-11，19-21］。在這一時期，可以將供體細胞直接導入到胚胎的循環(huán)系統(tǒng)中，使進入到胚體內的供體細胞的比例明顯增加。但若在胚胎免疫系統(tǒng)開始建立之后再將表達外源蛋白的供體細胞導入，供體細胞就可能會被胚胎免疫排斥。本實驗室前期在雞胚胎期誘導免疫耐受的研究中發(fā)現(xiàn)：在胚胎發(fā)育65～70h階段接種抗原后孵化的小雞中表現(xiàn)出對這種蛋白抗原的耐受［22］。所以本實驗選擇了雞胚孵化65～70h時通過血管微注射的方法導入供體細胞，以增加供體細胞在受體中存活的比例。

3.2 受體的陽性率

本實驗采用血管微注射法將供體細胞直接導入胚胎，提高了含有GFP細胞的胚胎比例。在本實驗中，含表達 GFP的DT40細胞的胚胎比例為86.6%(58/67)，遠高于2001年 Toba等［17］通過胚盤注射法將經基因修飾的DT40細胞導入雞胚的實驗以及2004年 Xi等［23］將轉基因融合細胞注入胚盤的實驗得到的嵌合胚胎陽性率，但低于我們之前以雞胚成纖維細胞(CEFs)作為供體細胞得到的實驗結果［24］。這可能是因為DT40細胞是經過改造且經長期體外培養(yǎng)的細胞系，已經不適于在胚胎體內長期生長所致。實驗中可以持續(xù)觀察到綠色熒光細胞，表明GFP基因均可以在導入受體后的DT40細胞中正常表達。

3.3 供體細胞在受體中的分布

供體細胞被導入雞胚循環(huán)系統(tǒng)后，可隨血液循環(huán)到達胚胎的各個部位，在胚體中分布廣泛，尤其在循環(huán)系統(tǒng)末端的毛細血管附近分布最多。由表1，熒光細胞最多出現(xiàn)在胚胎的腦和卵黃囊膜中，分別在52個胚胎腦中和55個胚胎的卵黃囊膜中存在熒光細胞，其次是心臟，在34個胚胎的心臟中檢測到熒光細胞。由于孵化5d的胚胎腦泡中水分比例非常大，經石蠟切片后腦泡部分呈空泡狀，通過免疫組化無法檢測到陽性細胞，但在腦泡附近的頭部組織中可以檢測到GFP陽性細胞。免疫組化結果與熒光檢測結果及PCR結果一致。

3.4 熒光細胞在受體體內存活的時間

熒光顯微鏡觀察結果表明，雞胚發(fā)育早期導入的DT40-GFP不但可以在雞胚內存活，而且其存活時間較長，可以持續(xù)到雞胚發(fā)育末期。但DT40-GFP細胞數(shù)量并未隨胚胎發(fā)育而增加，而是呈現(xiàn)出逐漸減少的趨勢。以本實驗的觀察結果與我們之前導入攜帶GFP基因的雞胚成纖維細胞(CEF-GFP)的實驗結果［24］相比較，兩實驗導入胚胎的細胞數(shù)量均為6×104個/胚。在注射后第1d，即胚胎孵化第4d，兩實驗的胚胎中熒光細胞的數(shù)量基本相同。總體上看，在胚胎孵化至第9 d時，注射DT40-GFP細胞的胚胎中的熒光細胞數(shù)量少于注射CEF-GFP細胞的胚胎中的熒光細胞數(shù)。胚胎孵化至15d時，注射DT40-GFP細胞的胚胎中的熒光細胞數(shù)量遠少于注射CEF-GFP細胞的胚胎中的熒光細胞數(shù)。

3.5 結論

本實驗將穩(wěn)定整合了一個拷貝綠色熒光蛋白基因的DT40細胞在雞胚發(fā)育65～70h時通過血管微注射法導入雞胚中，整合了外源基因的DT40細胞可以在胚胎中存活直至胚胎出雛之前，且外源基因能夠持續(xù)表達。這一結果表明，可以通過此方法將外源基因導入到受體中，并使目的蛋白在受體胚胎中持續(xù)表達，可以為深入研究免疫耐受的機制提供一定的技術支持。

［1］Mohammed SM，Morrison S，W ims L，et al.Deposition of genetically engineered human antibodies into the egg yolk of hens［J］.Immunotechnology，1998，4(2)：115-125.

［2］Murray M，Kim D，Liu Y，et al.Transplantation of genetically modified cells contributes to repair and recovery from spinal injury［J］.Brain Research Reviews，2002，40(1-3)：292-300.

［3］Domenico CD，Villani GRD，Napoli DD，et al.Gene therapy for a mucopolysaccharidosis type I murine model with lentiviral-IDUA vector［J］.Human Gene Therapy，2005，16(1)：81-90.

［4］Schagen FHE，Ossevoort M， Toes REM， et al. Immune responses against adenoviral vectors and their transgene products： a review of strategies for evasion［J］.Critical Reviews in Oncology and Hematology，2004，50(1)：51-70.

［5］Jooss K，Yang Y，F(xiàn)isher KJ，et al.Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers［J］.Journal of Virology，1998，72(5)：4212-4223.

［6］Burnet FM.The clonal selection theory of acquired immunity［M］.London：Cambridge University Press，1959.

［7］Stevens KM， Pietryk HC and Ciminera JK. Acquired immunological tolerance to protein antigen in chickens［J］.British Journal of Experimental Pathology，1958，39(1)：1-7.

［8］Naito M，Tajima A，Yasuda Y，et al.Production of germ line chimeric chickens，with high transmission rate of donor-derived gametes，produced by transfer of primordial germ cells［J］.Molecular Reproduction and Development，1994，39(2)：153-161.

［9］Li HC，Zhao L，Kagami H，et al.Identification of transferred chicken germ cells in quail gonad and semen by amplification of chicken-specific PCR products［J］.The Journal of Poultry Science，2001，38(4)：308-316.

［10］Naito M，Minematsu T，Harumi T，et al.Preferential m igration of transferred primordial germ cells to left germinal ridge of recipient embryos in chickens［J］.The Journal of Poultry Science，2009，46(1)：40-45.

［11］Naito M，Minematsu T，Harumi T，et al.Intense expression of GFP gene in gonads of chicken embryos by transfecting circulating primordial germ cells in vitro and in vivo［J］.The Journal of Poultry Science，2007，44(4)：416-425.

［12］Zhao C，Song C，Wang X，et al.Induction of immunological tolerance in chickens inoculated with xenogeneic antigens at an early stage of embryonic development［J］.Developmental and Comparative Immunology，2006，30(4)：431-440.

［13］Hamburger V and Hamilton HL.A series of normal stages in the development of the chick embryo［J］.Journal of Morphology，1951，88(1)：49-92.

［14］Taberlet P and Bouvet J.A single plucked feather as a source of DNA for bird genetic studies［J］.The Auk，1991，108(4)：959-960.

［15］Naito M，Watanabe M，Kinutani M，et al.Production of quailchick chimaeras by blastoderm cell transfer［J］.British poultry science，1991，32(1)：79-86.

［16］Petitte JN.Production of somatic and germ line chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells ［J］.Development，1990，108(1)：185-189.

［17］Toba M，Ebara F，F(xiàn)uruta H，et al.Introduction of DT40cells into chick embryos［J］.Asian Journal of Andrology，2001，3(1)：49-53.

［18］Zhu L，van de Lavoir MC，A lbanese J，et al.Production of human monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens［J］.Nature Biotechnology，2005，23(9)：1159-1169.

［19］Naito M，Cryopreservation of avian germ line cells and subsequent production of viable offspring［J］.The Journal of Poultry Science，2003，40(1)：1-12.

［20］Tajima A，Barbato GF，Kuwana T，et al.Conservation of a genetically selected broiler line(42L) using cryopreserved circulating primordial germ cells(PGCs)isolated by filtration method［J］.The Journal of Poultry Science，2003，40(1)：53-61.

［21］Minematsu T，Tajima A，and Kanai Y.The migratory ability of gonadal germ cells in the domestic chicken［J］.The Journal of Poultry Science，2004，41(3)：178-185.

［22］Zhao C，Li Z，Song C，et al.Induction of immune-tolerance in chickens by injecting exogenous antigen into embryonic blood vessel during embryogenesis［C］.Proceeding ofⅩⅫ World's Poultry Congress，2004，178.

［23］Xi Y，Nada Y，Soh T，et al.Green fluorescent protein genetransfected peafowl somatic cells participate in the development of chicken embryos［J］.Journal of Experimental Zoology Part A，2004，301(2)：139-149.

［24］Sun P，Zhao C，Yan L，et al.Expression of green fluorescent protein gene in somatic chimeric chickens produced by transplantation of transfected chicken embryonic fibroblasts［J］.The Journal of Poultry Science，2009，46(4)：363-369.