心臟特異表達(dá)人源FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

張 麗，全雄志，董 偉，高 翔，劉 寧，徐艷峰，張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

擴(kuò)張型心肌病是一種以心腔(左心室和/或右心室)擴(kuò)張、心肌收縮功能受損為主要特征的原因不明的心肌疾?。?］，是除冠心病和高血壓以外導(dǎo)致心力衰竭的主要病因之一，5年內(nèi)病死率高達(dá)15%～50%。

本室建立了心臟特異表達(dá) cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠，cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠全心擴(kuò)大，室壁變薄，間質(zhì)纖維化，心肌收縮功能失調(diào)［2］，表現(xiàn)出典型的擴(kuò)張型心肌病病理表型。

FAM55A(fam ily with sequence similarity 55member A)是一個(gè)假說基因，基因功能仍有待于研究。cTnTR141W疾病模型動(dòng)物心臟全基因表達(dá)芯片結(jié)果顯示，F(xiàn)AM55A在擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物模型心肌中mRNA表達(dá)上調(diào)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn) cTnTR141W擴(kuò)張型心肌病小鼠心臟中FAM55A蛋白表達(dá)顯著高于比野生型小鼠，推測FAM55A可能是心肌病發(fā)生發(fā)展中的修飾基因之一。因此，本研究建立心臟特異人源FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠，以對該基因的功能及其對心肌病的影響進(jìn)行初步探索。

1 材料和方法

1.1 FAM 55A表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

以pCMV-SPORT6-FAM55A質(zhì)粒(Open Biosystems，美國，Clone ID5186472)為模板，PCR擴(kuò)增小鼠FAM55A全長cDNA，上、下游引物分別為5'-GTCGACCTGAGGGCCAGGATGTCCTCC-3' 5'-GTCGACATCCCTTAGCAAATGTAGTTTAAGAAC-3'，引物5'端均帶有SalI酶切位點(diǎn)(帶下劃線)，目的基因FAM55A為1235bp。將擴(kuò)增片段插入pMD18T載體，經(jīng)測序并比對正確無突變堿基后，以SalI (寶生物工程有限公司，中國)酶切回收 FAM55A片段，并克隆入 α-MHC啟動(dòng)子［Genbank Accession no.U_71441(clone 26)］下游構(gòu)建心臟特異人源FAM55A表達(dá)載體，用 NotⅠ(寶生物工程有限公司，中國)將其線性化，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到 C57BL/6J小鼠(康藍(lán)公司［SCXK (京)2004001］)的受精卵中，用ICR小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK(京)2006-0009］)作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠(TE2000U顯微注射儀)［3］。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(GC-08-2031)。

1.2 PCR鑒定FAM 55A轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14d用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組 DNA［4］，用PCR法對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測。αMHCFAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠PCR引物序列如下，上游引物為：5'-CCTCCTGTCCCTGGTGGTT-3'，下游引物為：5'-CGATGGCCCTGCGAATAA-3'(上海生物工程技術(shù)有限公司，中國)。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5m in，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)。瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物，目的產(chǎn)物FAM55A片段431bp。

1.3 Western Blot檢測FAM 55A的表達(dá)

提取3月齡野生對照小鼠和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟總蛋白；提取 F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠及同窩陰性小鼠的心臟總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到0.45μm硝酸纖維素膜上，置于5%的脫脂奶粉封閉液中，室溫1h，加入TBST稀釋的鼠抗 FAM55A多克隆抗體(1∶500) (H00120400-B01，Novus Biologicals，美國)，4℃ 孵育過夜，用TBST洗膜三次，每次10min。然后加入1∶15000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫雜交1h。采用HRP-GAPDH(康成生物，中國)作為內(nèi)參，棄去二抗，TBST洗膜三次，每次5m in，TBS洗膜一次，10min。將膜置于化學(xué)發(fā)光劑中，用X光膠片曝光。

1.4 超聲檢查FAM 55A轉(zhuǎn)基因小鼠

選用不同月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性小鼠，飽和三溴乙醇麻醉，選用30Hz的探頭，進(jìn)行心臟超聲影像分析［5］(Vevo770小動(dòng)物超聲探測系統(tǒng)，加拿

大)。

1.5 組織學(xué)檢測

選用5月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，打開胸腔取出心臟，將心臟組織固定在中性福爾馬林中24h，進(jìn)行脫水、包埋、切片，HE染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理。先進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立性t檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 FAM55A在野生鼠和 cTnT轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中的表達(dá)

提取3月齡野生鼠和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織總蛋白，Western blot分析FAM55A在心臟組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM55A在擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物模型心肌中表達(dá)顯著上調(diào)(圖1)。

圖1 FAM55A在野生鼠和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中的表達(dá)Fig.1 The expression of FAM 55A gene in the heart tissues of wild type mice and cTnTR141W transgenic mice注：分離3月齡野生鼠和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟組織總蛋白，GADPH作為內(nèi)對照Note：The total lysates of heart tissues were isolated from the wild mice and cTnTR141W transgenic mice at 3months of age，the GADPH was used as normalization

2.2 FAM 55A的小鼠組織表達(dá)譜

提取3月齡野生鼠心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸組織總蛋白，Western blot分析FAM55A在各組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM55A于肺組織中表達(dá)最高，心臟、肝、脾、腎等組織中表達(dá)較少，腦和睪丸中表達(dá)最少(圖2)。

2.3 FAM 55A轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

PCR擴(kuò)增人FAM55A基因，插入PMD-18T載體測序，測序結(jié)果表明克隆的cDNA同已報(bào)道FAM55A序列完全一致(GenBank No.BC029049.1)，將 FAM55A基因插入心臟特異表達(dá)的α-MHC啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建FAM55A轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體(圖3A)。用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入受體假孕 ICR小鼠中，小鼠出生14d提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增FAM55A基因431bp目的片段，鑒定FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型(圖3B)，共得到5只首建鼠，且均可傳代。分別提取FAM55A首建鼠的F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性對照小鼠心臟組織總蛋白，用FAM55A多克隆抗體進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果顯示44號(hào)首建鼠心臟組織內(nèi) FAM55A蛋白表達(dá)量明顯高于同齡陰性對照小鼠(圖3C)。

圖2 FAM55A在野生小鼠不同組織中的表達(dá)Fig.2 The expression of FAM55A gene in the tissues of wild type mice注：分離3月齡小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸組織的總蛋白，用Western blot檢測FAM 55A基因在不同組織中的表達(dá)水平，GADPH作為內(nèi)對照Note：The total lysates of heart，liver，sp leen，lung，kidney，brain，and testis tissues were isolated from the wild mice at3months of age.The expression of FAM 55A gene was detected by Western blot and the GADPH was used as normalization

2.4 超聲檢查FAM 55A轉(zhuǎn)基因小鼠心臟的結(jié)構(gòu)及功能

1、3、5月齡FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性小鼠進(jìn)行心臟超聲影像分析(表1)，結(jié)果顯示，1月齡FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡野生型小鼠相比，收縮期左室內(nèi)徑(LVID，s)增加了10%(P＜0.05，n= 12)，舒張期左室前壁厚度(LVAW，d)和收縮期左室前壁厚度(LVAW，s)分別增加了 29.5%和23.5%(P＜0.01，n=12)；3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)增加 6.7%(P＜0.05，n=12)，短軸縮短率(fraction shortening，F(xiàn)S)增加9.8%(P＜0.05，n=12)，舒張期左室前壁厚度(LVAW，d)和收縮期左室前壁厚度(LVAW，s)分別增加了28.2%和24.1%(P＜0.01，n=12)；5月齡FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率相對于野生型小鼠無變化，舒張期左室前壁厚度(LVAW，d)和收縮期左室前壁厚度(LVAW，s)分別增加了14.3%和31.6%(P＜0.01，n=12)。

圖3 FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠的建立Fig.3 Generation of FAM55A transgenic mice注：A，F(xiàn)AM 55A轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體；B，基因型鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠PCR結(jié)果；M，DL2000；1～18，鼠尾DNA樣品，共鑒定出3、7、16、17和18，5個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。C，F(xiàn)AM55A在44#轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中的表達(dá)，以野生型(WT)為陰性對照小鼠，GAPDH加樣一致性對照Note：A FAM55A transgenic expression construct.B Genotyping of FAM 55A transgenic mice detected by PCR.M DL2000DNA marker.1～18mice genom ic DNA samples.The totally 5founders were screened as shown in lanes of 3、7、16、17and 18.C was expression of FAM55Ain the 44#transgenic mice detected by western blot，and compared withthat of the wild type m ice control(WT).GAPDH was used as loading control

表1 1、3、5月齡野生型小鼠和FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠M超聲參數(shù)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)Tab.1 Independent samples t test of wild type and FAM 55A transgenic m ice at 1，3and 5months of age

2.5 FAM 55A轉(zhuǎn)基因小鼠心臟病理學(xué)檢查

將5月齡FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對照小鼠的心臟進(jìn)行病理解剖，進(jìn)行HE染色。HE染色可見FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠心臟心肌細(xì)胞不均勻肥大，但不發(fā)生排列紊亂(封3圖4)。

3 討論

FAM55A基因?yàn)橐粋€(gè)假說基因，目前還沒有關(guān)于該基因功能的報(bào)道，更沒有和心肌病之間聯(lián)系的相關(guān)報(bào)道。本文利用Western Blot檢測了FAM55A在野生型小鼠多個(gè)組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺組織中表達(dá)最高，腦和睪丸中表達(dá)極少，心臟組織中有少量表達(dá)。并發(fā)現(xiàn) FAM55A在 cTnTR141W擴(kuò)張型心肌病小鼠模型心臟組織中的表達(dá)比野生型小鼠高，推測其對心臟發(fā)育可能具有重要的作用。

本文中，建立了心臟特異表達(dá)的人源 FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠。Western Blot結(jié)果顯示，F(xiàn)AM55A在44號(hào)首建鼠心臟組織中與野生型小鼠相比有較高表達(dá)。對轉(zhuǎn)基因小鼠1月齡到5月齡的追蹤超聲檢查，發(fā)現(xiàn)FAM55A基因的高表達(dá)導(dǎo)致心臟收縮期和舒張期左室前壁持續(xù)增厚，3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率稍有增強(qiáng)，1月齡和5月齡轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能相對于同齡野生鼠無變化。心臟組織病理觀察結(jié)果顯示，F(xiàn)AM55A轉(zhuǎn)基因小鼠心臟心肌細(xì)胞雖有肥大但不發(fā)生紊亂?？傊?，F(xiàn)AM55A轉(zhuǎn)基因小鼠心臟左心室發(fā)生肥厚，心功能有所增強(qiáng)，推測FAM55A基因的過表達(dá)可能和代償性肥厚有關(guān)。

目前，F(xiàn)AM55A基因是一個(gè)新基因，本文成功建立了心臟特異表達(dá)的人源FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠，此轉(zhuǎn)基因小鼠的建立為進(jìn)一步研究 FAM55A對心臟正常發(fā)育的影響，以及FAM55A在心肌病的發(fā)生過程中的生物學(xué)功能及可能的機(jī)制提供了工具動(dòng)物。FAM55A轉(zhuǎn)基因小鼠與轉(zhuǎn)基因擴(kuò)張型心肌病和肥厚型心肌病小鼠雜交或者對轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)施手術(shù)的方法，可進(jìn)一步研究FAM55A在心肌病發(fā)病中的作用，為心肌病的機(jī)制研究和治療提供線索。

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