食品動物細(xì)胞色素P450的研究進(jìn)展

劉兆穎，伍 勇(綜述)，孫志良(審校)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，長沙410128)

細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)是一復(fù)雜的多酶體系，CYP多肽鏈的分子量因動物種屬不同而異。CYP酶系的特異性及底物重疊性，大部分是由于存在大量CYP同工酶，這些酶的氨基酸序列具有高度同源性，可歸于同源蛋白質(zhì)。食品動物CYP是指參與食品動物(豬、牛、羊、雞、魚等)機(jī)體內(nèi)各種外源物質(zhì)，如獸藥、飼料添加劑、環(huán)境污染物等異物代謝轉(zhuǎn)化的P450酶系的總稱。研究食品動物細(xì)胞色素P450，有利于指導(dǎo)獸醫(yī)臨床合理用藥，避免中毒和藥物的相互作用;指導(dǎo)新獸藥設(shè)計與劑型改進(jìn);也有利于指導(dǎo)殘留分析和殘留監(jiān)控，保障食品安全和消費(fèi)者的健康。因此，食品動物中CYP的研究越來越受到國內(nèi)外的重視。目前，研究人和實驗動物CYP的報道較多，而研究食品動物中CYP相對很少，且大部分研究只證明了CYP在食品動物中的表達(dá)和活性，而與獸藥的聯(lián)系不緊密。在此將國內(nèi)外有關(guān)食品動物中細(xì)胞色素P450酶的影響因素，幾種細(xì)胞色素P450同工酶在食品動物中的表達(dá)和活性等方面的研究進(jìn)展予以綜述，為獸藥的CYP進(jìn)一步研究提供重要的基礎(chǔ)。

1 CYP1A

CYP1A除參與有機(jī)環(huán)境污染物的生物轉(zhuǎn)化外，一些獸藥也可經(jīng)該酶代謝，如阿苯噠唑、噻苯噠唑、甲苯噠唑、咖啡因和雌二醇，CYP1A能活化一些多環(huán)芳香烴和聚氯聯(lián)(二)苯等前致癌物。豬體內(nèi)CYP1A同工酶雖然證實它可被β-萘黃酮或多氯聯(lián)苯所誘導(dǎo)，但目前尚未進(jìn)行測序研究［1，2］Western雜交發(fā)現(xiàn)豬、牛和羊的CYP1A與人的CYP1A2抗體無交叉反應(yīng)，但與抗鼠CYP1A1/2 IgG有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)［3］。豬的 CYP1A蛋白與抗兔CYP1A1/2有較弱的交叉反應(yīng)［4］。用 CYP1A的特征底物和Western雜交發(fā)現(xiàn):牛肝中的 CYP1A活性很高，與綿抗大鼠CYP1A1存在很高的交叉反應(yīng)，并推測牛中可能存在兩種CYP1A同工酶［5］。CYP1A亞家族可被植物中的許多營養(yǎng)素所誘導(dǎo)［6］，因此，牛中高表達(dá)的CYP1A可能與此有關(guān)。目前，從雞胚肝中純化和確定了四氧二苯二氧雜環(huán)己二烯誘導(dǎo)的兩個CYP，一個命名為CYP1A4，具有乙氧-9-羥基異吩噻唑-O-脫乙基酶和芳香烴羥化酶的活性;另一個命名為CYP1A5，具有四氧二苯二氧雜環(huán)己二烯誘導(dǎo)的花生四烯酸的環(huán)氧化和他莫昔芬的4-羥化，但沒有乙氧-9-羥基異吩噻唑-O-脫乙基酶和芳香烴羥化酶的活性［7-8］。并對雞的CYP1A進(jìn)行了克隆和表達(dá)［9］。魚的CYP1A基因可作為評價水生環(huán)境污染的生物標(biāo)志物，但是，魚的CYP1A在不同品種之間的序列相似性不高CYP1A抗體在不同魚物種間的交叉反應(yīng)很低。目前，從雌雄同體魚中克隆了CYP1A的cDNA序列，并在大腸埃希菌中重組表達(dá)成功［10］。

2 CYP2A

目前，從豬肝微粒體中分離、純化了CYP2A，并用免疫染色分析N-末端的20個氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)有14個氨基酸與人的CYP2A6相同(70%)［11］。并且研究發(fā)現(xiàn)豬個體之間存在很大的CYP2A代謝差異引起這差異的原因并不是豬中存在CYP2A多態(tài)性而是由于轉(zhuǎn)錄調(diào)控［12］，該基因在小豬中有1620 bp和1795 bp兩條 cDNAs(GenBank accession number AY380866)，長的或野生型cDNA與豬CYP2A19序列同源(GenBank accession number AB052255)，該基因編碼的蛋白有99%與CYP2A19一致，即494個氨基酸中有493個是一樣的;短的cDNA與普通豬CYP2A19序列相似，該基因編碼487個氨基酸，前面466個中有464個與普通豬CYP2A19一樣，409個與人的CYP2A6，其他的氨基酸都不同。普通豬和小豬的野生型CYP2A包含6個底物識別位點(diǎn)，而短的CYP2A只有前5個底物識別位點(diǎn)。

3 CYP2C

從豬的小腸cDNA文庫中轉(zhuǎn)錄了CYP2C42基因，該基因是由327個氨基酸編碼的開放讀碼框架，并不是全長的克隆。Zaphiropoulos等［4］用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法從排卵前的濾泡中得到了5條cDNA克隆，以cDNA為模板擴(kuò)增，得到5個DNA雙鏈，分別命名為CYP2C32、CYP2C33、CYP2C34、CYP2C35、CYP2C36。從豬肝微粒體中分離、純化了CYP2C，并用免疫染色分析N-末端的20個氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)有10個氨基酸與人的CYP2C9相同(50%)［11］。Baader等［13］克隆了雞的第一個CYP2C亞家族cDNA，命名為CYP2C45，在發(fā)現(xiàn)該基因前，認(rèn)為雞中CYP2H1是CYP2C的類似物，苯巴比妥能誘導(dǎo)CYP2C45 mRNA增加，誘導(dǎo)的機(jī)制與CYP2H1基因的一個264 bp苯巴比妥反應(yīng)增強(qiáng)單位相似［14］，即在2.6 kb片段中有一個CYP2H1苯巴比妥反應(yīng)增強(qiáng)單位的核因子1位點(diǎn)和同向重復(fù)核受體結(jié)合位點(diǎn)。

4 CYP2D

牛的CYP2D蛋白已克隆，與人的CYP2D6相比，核苷酸序列只有不到7%的差別。目前，從豬的小腸cDNA文庫中已轉(zhuǎn)錄了CYP2D25基因［15］，在豬的肝微粒體中也分離了CYP2D25，該蛋白77%以上的序列與人的CYP2D6相同，并催化一些共同的底物，如普萘洛爾、丁呋洛爾、右美沙芬和托特羅定［2］。而人的CYP2D6不能催化維生素D的25-羥化［16］。Sakuma等［15］總結(jié)了不同種屬的 CYP2D同工酶與人的CYP2D6核苷酸和氨基酸序列的一致性(表1)。

5 CYP2E

CYP2E1主要參與一些低分子質(zhì)量異物的代謝活化。小豬的CYP2E1已經(jīng)分離純化、cDNA克隆和測序，豬和小豬的CYP2E1由496個氨基酸組成，比人的少兩個殘基。豬和小豬的CYP2E1結(jié)構(gòu)上只有細(xì)微的差別，即第346位的氨基酸不同，豬的是纈氨酸，小豬的是天冬氨酸，而人的是谷氨酸，這樣，小豬的CYP2E1跟人的更相似［17］。CYP2E1的結(jié)構(gòu)是CYP中最保守的酶之一，在不同種屬之間，將近80%的氨基酸序列是一致的［16］，因此，許多動物都有相似的催化特征。豬與人的CYP2E1結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)別是底物識別［18］，豬在該區(qū)域的兩個氨基酸是His92和Asn95，而人的都是天冬氨酸。

表1 其他動物CYP2D同工酶與人CYP2D6核苷酸和氨基酸序列的比較

6 CYP3A

CYP3A是異物代謝中最重要的CYP，參與的底物相當(dāng)廣泛。Western雜交發(fā)現(xiàn)豬、牛和羊的CYP3A蛋白與抗人的CYP3A4 IgG有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，但與抗鼠CYP3A1 IgG的交叉反應(yīng)較弱。在V79中國倉鼠細(xì)胞中表達(dá)了牛的全長CYP3A cDNA序列，該蛋白能使睪酮包括6β在內(nèi)的許多位置的羥化，也能被CYP3A抑制劑酮康唑所抑制［19］。van't Klooster等［20］用抗鼠CYP3A1的單克隆抗體檢測到牛后線粒體液一條免疫反應(yīng)蛋白。并有研究者從綿羊中純化了CYP3A蛋白，該蛋白能被醋竹桃霉素誘導(dǎo)，催化紅霉素、氯丙嗪、氯苯那敏和溴己新的 N-脫甲基化［21］。目前，從豬的小腸 cDNA文庫中已轉(zhuǎn)錄了CYP3A29基因，從豬肝微粒體中分離、純化了CYP3A29，并用免疫染色分析N-末端的20個氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)有12個氨基酸與人的 CYP3A4相同(60%)。不同種屬的CYP3A同工酶與人的CYP3A4核苷酸和氨基酸序列的比較見表2。

7 CYP4A

CYP4A包含許多同工酶，主要催化各種脂肪酸的ω和ω-1氧化，包括月桂酸、花生四烯酸和前列腺素［22］。比較豬、牛、山羊和綿羊肝微粒體的12-月桂酸羥化酶的活性，發(fā)現(xiàn)羊肝中的12-月桂酸羥化酶的活性很高。豬的CYP4A21在底物特異性和結(jié)構(gòu)特征上與其他的CYP4A不同，它是CYP4A中唯一催化脫氧鵝膽酸的 6α-羥化，參與膽汁酸的合成CYP4A21有 95% 的基因序列與 CYP4A24和CYP4A25相同，大小約13 kb，有12個外顯子，并且研究表明豬的CYP4A21和CYP4A24的基因都是從一個遺傳基因復(fù)制而來，其5'末端高度一致，主要不同的是6～8外顯子之間的核苷酸序列［23］。

表2 其他動物CYP3A同工酶與人CYP3A4核苷酸和氨基酸序列的比較

8 展望

目前對食品動物細(xì)胞色素P450酶的研究還只停留在代謝酶序列種屬差異比較、活性及含量測定等常規(guī)研究上，而對CYP參與獸藥代謝，CYP作用的分子機(jī)制、表達(dá)調(diào)控及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及翻譯后修飾等領(lǐng)域的研究有待進(jìn)一步深入。隨著生物學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、畜牧業(yè)及分子藥理學(xué)、藥效學(xué)、毒理學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和新儀器新技術(shù)的出現(xiàn)，先進(jìn)實驗技術(shù)和檢測技術(shù)也在不斷地增加，藥物代謝酶及相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域必將有廣闊的發(fā)展前景。目前，細(xì)胞色素P450等代謝酶的分子生物學(xué)研究已深入到基因表達(dá)的調(diào)控，使對酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪裁從而改變其活性進(jìn)而改變藥物的代謝過程，并應(yīng)用于藥物代謝研究領(lǐng)域成為可能。同時由于蛋白質(zhì)組學(xué)及其他新技術(shù)的發(fā)展，CYP基因的調(diào)控機(jī)制及CYP結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，脂溶性CYP晶體結(jié)構(gòu)模擬將成為今后獸藥代謝酶的研究熱點(diǎn)。

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