硫酸鋇比濁法測(cè)定皂角多糖修飾物中硫酸基的研究

張亞男

(泰山學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，山東 泰安 271021)

多糖是生物有機(jī)體內(nèi)普遍存在的一類生物大分子，既以游離的形式參與生命過程，又與蛋白質(zhì)、肽及脂質(zhì)等組成聚合物的形式;它不僅參與組織細(xì)胞骨架的構(gòu)成，而且是多種內(nèi)源性生物活性分子的重要組成成分;它在生理機(jī)能的平衡與穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)廣泛參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)而產(chǎn)生多種生物學(xué)功能［1－2］.某些植物多糖特別是其修飾物具有抗血栓、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)細(xì)胞免疫和機(jī)體免疫功能、抗氧化、對(duì)機(jī)體細(xì)胞的保護(hù)等作用［3－10］.活性多糖的研究已成為當(dāng)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)，它的重要特征是在多糖鏈上具有硫酸基，而且其活性與分子中硫酸基的含量有著直接關(guān)系，硫酸基含量越高，其抗HIV病毒的作用越強(qiáng)［11］.因此，準(zhǔn)確測(cè)定硫酸基含量是十分重要的.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)，PHAMACIA UV2000.

硫酸基標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的Na2SO488.6 mg溶于1mol/L的鹽酸中(SO24－濃度為0.6 mg/mL);明膠:分別配制成0.25%、0.50%、0.75%的溶液，冷藏保存;氯化鋇:1 g氯化鋇溶于100 mL明膠溶液中;三氯乙酸:2%、3%、5%的水溶液.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

通過鹽酸水解從皂角多糖修飾物中釋放硫酸基，與BaCl2生成硫酸鋇，SO24－含量與其吸光度呈線性關(guān)系，用分光光度計(jì)在360nm處，測(cè)定其吸光度值，計(jì)算出硫酸基的含量.以線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)和回收率為指標(biāo)考察試劑用量和水解條件對(duì)檢測(cè)方法的影響，確定最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，確定硫酸鋇比濁法檢測(cè)皂角多糖硫酸基含量的準(zhǔn)確性.

1.2.1 皂角多糖修飾物樣品(以下簡(jiǎn)稱樣品)的處理

稱取樣品100 mg，用1 mol/L HCl溶液(鹽酸濃度為考察條件之一)溶解，于100℃水浴中水解，冷卻后，加鹽酸溶液補(bǔ)至刻度線，用濾紙過濾，除去不溶物質(zhì)，即得粗樣品，保存?zhèn)溆?

1.2.2 紫外光譜的測(cè)定

取Na2SO4標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液各0.2 mL，加三氯乙酸溶液3.8 mL和氯化鋇溶液1mL，將其混勻，進(jìn)行紫外光譜測(cè)定.結(jié)果表明，Na2SO4和樣品均在360nm處有最大吸收峰.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)Na2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0.02mL，0.06mL，0.08mL，0.10mL，0.12mL，0.14mL，0.16mL，0.20mL，以鹽酸溶液補(bǔ)至0.2mL，以0.2 mLHCl溶液作為空白，加入三氯乙酸3.8 mL及氯化鋇溶液1.0 mL，搖勻，室溫靜置15 min，于360 nm測(cè)吸光度A1;以1.0 mL明膠溶液代替氯化鋇溶液，測(cè)吸收度A2;以硫酸基質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A1－A2)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍及線性關(guān)系.其中每點(diǎn)做三個(gè)平行樣品，取平均值.

1.2.4 回收率試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和樣品溶液按比例搖勻，取0.15ml按硫酸基含量測(cè)定方法測(cè)定SO2－4含量，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%［12］.

2 結(jié)果與討論

2.1 明膠濃度的影響

通過繪制Na2SO4與不同濃度明膠混合反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線并且測(cè)定回收率，考察明膠濃度對(duì)線性關(guān)系的影響［13－14］，確定硫酸比濁法中適宜的明膠濃度.

按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，控制C(SO2－4)在0～60μg/ml(HCl補(bǔ)足至0.5 ml)，3%三氯乙酸加入量3.5ml，分別用0%(超純水代替)、0.25%、0.5%、0.75%的明膠配制的1%的BaCl2加入量1ml.標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)結(jié)果見表1，不同濃度明膠的回收率結(jié)果見表2.

表1 不同明膠濃度的線性關(guān)系考察結(jié)果

表2 不同濃度明膠的回收率

由表1可以看出明膠濃度對(duì)線性關(guān)系影響很小，去除相關(guān)系數(shù)最小的0%的明膠，其他濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R都高于0.994.用回收率考察明膠的影響結(jié)果(表2)可以看出0.25%的明膠線性關(guān)系雖然很好，但是平均回收率非常低.明膠濃度為0.5%和0.75%的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系和回收率都比較好，其中明膠濃度為0.5%時(shí)平均回收率為98.47%，RSD%為3.42%;明膠濃度為0.75%時(shí)平均回收率為100.97%，RSD%為4.33%，綜合看明膠濃度為0.75%時(shí)測(cè)得的回收率更好，故適宜的明膠濃度為0.75%.

2.2 三氯乙酸濃度的影響

取0.75%的明膠作為溶劑配制1%的BaCl2.控制三氯乙酸加入量3.5ml，1%的BaCl2加入量1 ml的條件下，考察不同濃度三氯乙酸對(duì)線性關(guān)系的影響，操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，不同濃度三氯乙酸的回收率結(jié)果見表4.

表3 不同三氯乙酸濃度的線性關(guān)系考察結(jié)果

表4 不同濃度三氯乙酸下的回收率

由表3可以看出三氯乙酸濃度對(duì)線性關(guān)系影響很小，三氯乙酸濃度0%～5%范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)都高于0.99.由表4可以看出三氯乙酸濃度為0%和2%時(shí)回收率較低，三氯乙酸濃度為3%時(shí)回收率的平均值為98.47%，RSD%為6.52%，三氯乙酸濃度為5%時(shí)回收率的平均值為101.59%，RSD%為9.35%，結(jié)合兩者看出3%的三氯乙酸測(cè)定結(jié)果更好，因此測(cè)定過程中三氯乙酸濃度宜為3%.

2.3 水解時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

選取三氯乙酸濃度為3%，明膠濃度為0.75%，按標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行操作.稱取的微量樣品用1molHCl以1mg/ml溶解好之后，放進(jìn)超級(jí)恒溫器水解，控制水解溫度100℃，取出不同時(shí)間的樣品溶液測(cè)吸光度，并分別計(jì)算硫酸基質(zhì)量濃度C(SO2－4)、硫的質(zhì)量濃度Cs及硫的質(zhì)量百分含量s%，以s%為指標(biāo)，考察水解時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，測(cè)定結(jié)果見表5、圖1.

表5 水解時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

圖1 水解時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

由表5和圖1可以看出在加熱水解180分鐘時(shí)，吸光度和硫的質(zhì)量百分含量S%測(cè)定值最高，說明在180分鐘時(shí)樣品水解完全，硫酸根游離出來，而水解時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)生一些變化影響檢測(cè)結(jié)果，所以水解時(shí)間宜控制180分鐘，水解條件確定為100℃、3小時(shí).

2.4 水解時(shí)鹽酸濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

保持樣品溶液質(zhì)量濃度為1mg/mlHCl，改變鹽酸濃度，檢測(cè)用不同濃度鹽酸溶解的樣品在水解條件為100℃、3小時(shí)下的吸光度，并分別計(jì)算硫酸基質(zhì)量濃度C(SO2－4)、硫的質(zhì)量濃度Cs及硫質(zhì)量百分含量s%，以s%為指標(biāo)，確定適宜的鹽酸濃度.

為了使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，應(yīng)消除鹽酸中可能含有的硫的影響，以及考慮在加熱過程中鹽酸易揮發(fā)特性的影響，將未加入樣品的鹽酸管與加入樣品的鹽酸管一同在100℃下水解三小時(shí)，以便使兩者鹽酸的揮發(fā)量比較相近，空白與待測(cè)樣品測(cè)定時(shí)濃度較一致，使測(cè)量值更準(zhǔn)確.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6.

表6 鹽酸濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

由表6可以看出，鹽酸濃度在0.8～1.4mol/L之間時(shí)s%較大并且穩(wěn)定，說明在此條件多糖完全水解，過高的鹽酸濃度1.6mol會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，因此較適宜的鹽酸濃度是0.8～1.4mol/L，為了方便起見選擇濃度為1mol/L的鹽酸溶解樣品，進(jìn)行水解.

2.5 水解時(shí)鹽酸用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

保持樣品用1mol/L的HCl溶解，改變鹽酸的用量，檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的樣品在相同水解條件為100℃、3小時(shí)下的吸光度，計(jì)算硫的質(zhì)量百分含量s%.以s%為指標(biāo)，考察鹽酸用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響.同2.4操作步驟，將未加入樣品的鹽酸管與加入樣品的鹽酸管一同在100℃下水解三小時(shí)，測(cè)量結(jié)果見表7.

表7 鹽酸用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

由表7可以看出，鹽酸用量在4～6ml之間時(shí)s%較穩(wěn)定，說明此時(shí)多糖完全水解，硫酸根游離出來，而鹽酸用量較高時(shí)會(huì)影響測(cè)定結(jié)果.所以選擇用5ml鹽酸溶解樣品去加熱水解.

3 結(jié)論

通過對(duì)硫酸鋇光電比濁法測(cè)定皂角硫酸多糖中硫含量的各種影響因素進(jìn)行研究，得到相關(guān)的適宜測(cè)定條件.確定溶解氯化鋇的明膠濃度為0.75%，三氯乙酸濃度為3%，樣品溶液水解時(shí)間為3小時(shí)，溶解樣品的鹽酸濃度為1mol/L，每溶解1mg樣品鹽酸用量為5ml.對(duì)于該方法測(cè)定準(zhǔn)確性等內(nèi)容將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究.

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