板車消炎顆粒微生物限度檢查法的驗證

劉雅清

板車消炎顆粒微生物限度檢查法的驗證

劉雅清

目的 建立板車消炎顆粒的微生物限度檢查法。方法 按《中國藥典》2010年版的要求對細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法和控制菌檢查方法進行驗證。結(jié)果 板車消炎顆粒可按常規(guī)法進行微生物限度檢查。結(jié)論 藥品的微生物限度檢查法應(yīng)進行驗證,以保證結(jié)果的準確性。

微生物限度檢查法;驗證試驗

板車消炎顆粒由板藍根、車前草等中藥制成,具有清熱解毒功效,用于病毒性感冒、扁桃腺炎、流行性腮腺炎等?！吨袊幍洹?010年版規(guī)定,建立藥品的微生物限度檢查法,應(yīng)進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證和控制菌檢查方法的驗證,以確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查。本文按《中國藥典》2010年版的要求就板車消炎顆粒的微生物限度檢查法進行驗證試驗。

1 儀器與試藥

SW-CJ-1F凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);大腸埃希菌[CMCC(B)44102],金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003],枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501],白色念珠菌[CMCC(F)98001],黑曲霉[CMCC(F)98003](中國藥品生物制品檢定所);營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,改良馬丁培養(yǎng)基,改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基,膽鹽乳糖培養(yǎng)基,4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養(yǎng)基,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司);蛋白胨(廣東光華化學(xué)廠有限公司);氯化鈉(廣東臺山市新寧制藥廠);磷酸氫二鈉(廣州化學(xué)試劑廠);磷酸二氫鉀(廣東臺山粵僑試劑塑料有限公司);聚山梨酯 80(北京市海淀會友精細化工廠);板車消炎顆粒(本院制劑室,批號:20101018,規(guī)格:每袋 10 g)。

對細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用的培養(yǎng)基和控制菌檢查用的培養(yǎng)基進行了適用性檢查,均符合規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液制備 取本品 10g,加 pH7.0無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液至 100ml,振搖,制成 1:10供試液。

2.2 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,30℃～35℃培養(yǎng)24h,用 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每 1ml含菌數(shù)為 50～100cfu的菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,20℃～25℃培養(yǎng) 48h,用 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每 1ml含菌數(shù)為 50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,培養(yǎng) 7d,加入5ml含 0.05%聚山梨酯 80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫,吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用含 0.05%聚山梨酯 80的 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每 1ml含孢子數(shù)為 50～100 cfu的孢子懸液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.3.1 試驗組 取供試液 1ml,加入到 1個平皿中,平行制備 10個平皿,分別加入已制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液 1ml(含 50～100cfu),每種菌平行制備 2個平皿,含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,置 30℃～35℃培養(yǎng) 3d,計數(shù);含白色念珠菌、黑曲霉的平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,置 23℃～28℃培養(yǎng) 5d,計數(shù)。

2.3.2 菌液組 分別取已制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液 1ml(含 50～100cfu),加入到 1個平皿中,各制備 2個平皿。培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、溫度、計數(shù)同 2.3.1。

2.3.3 供試品對照組 取供試液 1ml,加入到平皿中,平行制備 4個平皿。2個平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,另 2個平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)時間、溫度、計數(shù)同 2.3.1。

2.3.4 稀釋劑對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1ml,加入到 1個平皿中,平行制備 10個平皿,分別加入已制備好金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液 1ml(含 50～100cfu),每種菌平行制備 2個平皿。培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、溫度、計數(shù)同 2.3.1。

各試驗菌分別進行 3次獨立的平行試驗,計算每次試驗的回收率。稀釋劑對照組的菌回收率(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分數(shù))和試驗組的菌回收率(試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分數(shù))均應(yīng)不低于 70%。結(jié)果見表 1。

表 1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證結(jié)果

表 1的結(jié)果顯示 5株試驗菌株的回收率都高于 70%,且3次試驗回收率均可重現(xiàn),因此細菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)檢查可用常規(guī)法。

2.4 控制菌檢查方法的驗證 取供試液 10ml及 1ml已制備好的大腸埃希菌菌液(含 50～100cfu)加入 100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,置于 30℃ ～35℃培養(yǎng) 18～24h,按大腸埃希菌微生物限度檢查法進行檢查[1]。共進行 3次獨立的平行試驗,結(jié)果見表 2。

表 2 控制菌檢查法驗證結(jié)果

表 2的結(jié)果顯示板車消炎顆粒對其控制菌大腸埃希菌沒有抑制作用,可按常規(guī)方法進行大腸埃希菌的檢查。

3 討論

板車消炎顆粒微生物限度檢查的驗證試驗顯示其可按常規(guī)法進行檢查。

《中國藥典》從 2005年版起增加了微生物限度檢查方法驗證試驗的要求,本文按《中國藥典》2010年版的規(guī)定進行驗證。微生物試驗的結(jié)果易受試驗條件的影響,在進行微生物限度檢查時,應(yīng)保證在檢驗條件下的藥品濃度不足以抑制污染微生物的生長,因此任何藥品的微生物限度檢查法均需驗證,確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查[2]。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典 2010年版一部,2010:83-84.

[2] 許華玉,杜蕓,錢文靜,等.藥品微生物限度檢查法中細菌和真菌計數(shù)方法的驗證試驗.中國中藥雜志,2005,30(24):1918.

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