女性壓力性尿失禁動物模型的特質(zhì)研究

李晶晶，王東文

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是女性較為常見的一種排尿功能異常性疾病，全世界已有數(shù)千萬婦女患有尿失禁。但SUI的發(fā)病機制尚未明確，雖然尿道支持層的支托力減弱、尿道黏膜封閉功能減退和尿道固有括約肌缺陷在發(fā)病機制中的關(guān)鍵性已得到認可，然而在SUI的發(fā)病過程中，哪個占有更主要的地位沒有達成共識[1]。原因主要在于用于后續(xù)研究的SUI模型不統(tǒng)一，造成研究結(jié)果的差異。本實驗通過結(jié)合陰道擴張、卵巢切除、陰部神經(jīng)切斷的方法來模擬多因素作用下SUI的發(fā)生，為SUI的基礎(chǔ)研究提供一種有效、穩(wěn)定、可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的選擇

山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室（國家重點實驗室）動物中心提供40只6周齡健康雌性Wistar大鼠，平均體重約204 g，以統(tǒng)一飼料喂養(yǎng)。將實驗大鼠隨機分為4組，Ⅰ組為對照組（10只）；Ⅱ組為陰道擴張+卵巢切除組（10只）；Ⅲ組為陰部神經(jīng)切斷組（10只）；Ⅳ組為陰道擴張+卵巢切除+陰部神經(jīng)切斷組（10 只）。

1.2 動物模型建立方法

1.2.1 陰道擴張+卵巢切除+陰部神經(jīng)切斷組 用1%異戊巴比妥（0.34 ml/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉后將大鼠俯臥位固定，備皮，消毒取骶正中1.5 cm皮膚切口和雙側(cè)背部肌肉切口，分離肌肉及周圍組織暴露坐骨直腸窩，并于坐骨直腸窩內(nèi)分離陰部神經(jīng)，兩側(cè)各離斷1.5 cm，2-0絲線依次縫合肌肉和皮膚[2]。改仰臥位固定，背骶側(cè)墊無菌紗布，下腹部備皮，消毒取正中切口1.5 cm，于膀胱后方尋及雙角子宮，沿兩側(cè)子宮角向上探及雙側(cè)卵巢，分離、結(jié)扎周圍血管及子宮角后切除雙側(cè)卵巢。40萬U青霉素溶于1 ml無菌生理鹽水腹腔內(nèi)沖洗，2-0絲線依次縫合肌肉和皮膚。導(dǎo)尿排空膀胱后，用8F雙腔導(dǎo)尿管（頂部有氣囊）插入大鼠陰道2～3 cm，往氣囊內(nèi)注入5 ml無菌生理鹽水。陰道口前后壁縫合一針以防尿管脫落。使大鼠骶尾部緊靠桌邊，尿管下垂給予適當?shù)睦Γs100 g）。維持該狀態(tài)4 h后拔出尿管[3-4]。

1.2.2 陰道擴張 +卵巢切除組 大鼠用異戊巴比妥腹腔內(nèi)注射麻醉后，先俯臥位游離雙側(cè)陰部神經(jīng)不切斷，縫合各層后改仰臥位切除雙側(cè)卵巢及氣囊擴張陰道，維持4 h。

1.2.3 陰部神經(jīng)切斷組 大鼠用10%水合氯醛 （0.3 ml/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉后俯臥位離斷雙側(cè)陰部神經(jīng)，改仰臥位分離雙側(cè)卵巢不切除。

三組實驗動物均于術(shù)后3 d內(nèi)給予青霉素40萬U/d腹腔注射預(yù)防感染。正常對照組不做任何處理。術(shù)后1、4、8周分別對四組動物行尿動力學(xué)檢查。

1.3 尿動力學(xué)檢查[5-6]

尿動力學(xué)檢測儀（BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)）的壓力傳感器與微量輸液泵分別外接一根硬膜外導(dǎo)管，用無菌生理鹽水充滿管道，保證管道內(nèi)無空氣。用10%水合氯醛（0.3 ml／100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉動物后，仰臥位固定。排空大鼠膀胱后，尿道口碘伏消毒，將與儀器連接好的兩根涂有石蠟油的硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道插入膀胱，置入約3 cm。微泵以0.3 ml/min的速度開始向膀胱內(nèi)注入無菌生理鹽水；同時，尿動力學(xué)檢測儀開始檢測。以尿道口出現(xiàn)第1滴液體為準，記錄當時的膀胱容量和膀胱內(nèi)壓為最大膀胱容量和漏尿點壓，并截取壓力曲線圖。每只大鼠進行2次檢測，取其平均值。

1.4 噴嚏試驗[7]

上述檢查之后，先排空大鼠膀胱，用微泵注入生理鹽水，其量為先前測出的膀胱容量的一半。剪取一段鼠須，伸入大鼠鼻孔，致其出現(xiàn)噴嚏反射。仔細觀察噴嚏時有無液體從尿道口流出。

1.5 組織學(xué)檢查

1.5.1 取材與切片制備 所有大鼠在術(shù)后8周測完尿動力學(xué)之后取全段尿道及盆底肌群，置入10.0%中性甲醛固定12 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋，1.5 μm 厚切片，置 70℃烤箱 15 h，低溫保存?zhèn)溆谩Ｖ苽銱E染色切片。尿道組織切片做Masson染色觀察尿道變化。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色

1.5.2.1 主要試劑：兔抗大鼠Actin多克隆抗體（北京博奧森公司）；兔抗大鼠S-100蛋白（武漢博士德公司）；辣根酶標記羊抗兔多聚體（北京中山公司），顯色劑為DAB（北京中山公司）。

1.5.2.2 步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2室溫下孵育15min，清除內(nèi)源性過氧化物酶活性；三蒸水沖洗數(shù)次，0.01mmol/L PBS浸泡3 min×3次；切片置于0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，高溫高壓2.5 min修復(fù)抗原；冷卻至室溫后，PBS浸泡3 min×3次；向切片分別滴加1∶100的一抗溶液 （兔抗αactin、兔抗 S-100），37℃孵育 1 h 20 min 后放至室溫；PBS 浸泡3 min×3 次； 滴加二抗，37℃孵育 30 min，PBS 浸泡 3 min×3次；滴加100μl新鮮配制的DAB顯色液，室溫暗處顯色3～5min；自來水沖洗切片，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照實驗：以PBS代替一抗進行免疫組化染色。盆底肌組織切片中微絲及尿道組織切片中神經(jīng)細胞核陽性區(qū)域顯色為棕黃色至棕褐色。

1.5.3 圖像分析

經(jīng)顯微攝像掃描后，將圖像輸入計算機，用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計算切片免疫組化染色陽性區(qū)域灰度或陽性個數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

通過SPSS 17.0軟件對各組多個時間點所測漏尿點壓行重復(fù)測量的方差分析，對免疫組化結(jié)果行單因素方差分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

3只大鼠在實驗中死亡，其中Ⅱ組1只，Ⅳ組2只。Ⅱ組1只大鼠因插管損傷尿道無法進行后續(xù)測壓，退出實驗。最后進入統(tǒng)計學(xué)分析的大鼠為36只。

2.1 尿動力學(xué)結(jié)果

漏尿點壓（LPP），統(tǒng)計學(xué)分析顯示，Ⅲ組和Ⅳ組的LPP顯著低于Ⅰ組和Ⅱ組（P＜0.01）；Ⅱ組 LPP 低于Ⅰ組（P＜0.05）；Ⅲ組與Ⅳ組比較LPP差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 噴嚏負荷試驗

Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別有6、9、10只陽性，而Ⅰ組對照組無陽性。

2.3 組織學(xué)表現(xiàn)

2.3.1 尿道組織 全層尿道的HE及Masson染色 見圖1，可見Ⅲ、Ⅳ組與Ⅰ、Ⅱ組比較，尿道全層變薄，結(jié)構(gòu)不明顯，肌層萎縮。并用免疫組化檢測尿道外膜神經(jīng)細胞（S-100）含量，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，Ⅲ、Ⅳ組顯著低于Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.01）；Ⅰ組與Ⅱ組以及Ⅲ組與Ⅳ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3.2 盆底肌組織 切片中α肌動蛋白（α-actin）免疫組織化學(xué)染色陽性區(qū)域顯色為棕黃色至棕褐色。α-actin陽性區(qū)域灰度：Ⅰ組為（135.56±3.38），Ⅱ組為（141.55±7.94），Ⅲ組為（152.20±4.69），Ⅳ組（165.08±7.20）。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，Ⅳ組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Ⅲ組與Ⅰ、Ⅱ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅰ組與Ⅱ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.139）。

表1 各組在不同時間點LPP測定結(jié)果（ ±s，mm Hg）

表1 各組在不同時間點LPP測定結(jié)果（ ±s，mm Hg）

4周1周8周Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組組別 n 10 8 10 8 29.20±3.43 25.13±4.78 15.77±2.25 15.24±4.06 28.99±2.62 22.48±3.67 17.45±2.45 13.93±2.68 27.41±2.92 23.65±3.19 16.21±3.05 12.93±3.79

3 討論

按照國際控尿?qū)W會（ICS）的定義，SUI是構(gòu)成較嚴重的衛(wèi)生及社會問題，且客觀上能證實為不自主的尿液流出。這種常見的女性排尿功能異常性疾病發(fā)病率高，而且嚴重影響著廣大婦女的健康及生活。SUI的原因很復(fù)雜，影響因素較多，目前比較公認的主要有年齡因素、婚育因素、既往婦科手術(shù)史、長期的腹壓增高史等。但這些原因?qū)е耂UI發(fā)生的確切機制目前尚無定論，雖有很多文獻對建立SUI動物模型進行了探討，然而仍沒有提供統(tǒng)一的造模方式。SUI的發(fā)生是多因素作用的結(jié)果，目前常見的造模方式一般采取單一手段來模擬造成SUI的主要原因，沒有很好地模擬SUI的病理生理過程。本實驗通過結(jié)合陰道擴張模擬產(chǎn)傷、切除雙側(cè)卵巢模擬雌激素水平下降、切斷雙側(cè)陰部神經(jīng)模擬尿道外括約肌功能減退三種常見的造模方法來模擬多因素作用下SUI的發(fā)生。

模擬難產(chǎn)對盆底組織造成壓迫，導(dǎo)致缺血再灌注損傷，使盆底肌肉及結(jié)締組織退變、受損而薄弱，對膀胱頸和近端尿道的支持作用下降，導(dǎo)致其下移，尿道松弛，功能性尿道變短，尿道膀胱后角消失，尿道傾斜角增大，膀胱頸部呈漏斗狀并下垂，使增高的腹壓僅傳至膀胱而較少傳遞至尿道，以致尿道壓力不能同步升高，從而引起尿失禁。研究證實膀胱尿道上含有大量雌激素受體，尿道上皮黏膜下血管叢對雌激素敏感。雌激素可改善尿道周圍血流量，增加黏膜層的厚度，進而增加尿道閉合壓[8]；雌激素水平下降使尿道黏膜萎縮變薄、彈性下降，導(dǎo)致其封閉功能下降[9]，同時使盆底的一些膠原代謝改變，從而使盆底的支托力下降。激素水平下降還會使尿道周圍肌組織細胞凋亡率明顯升高，同樣使尿道阻力下降[10]。大鼠的陰部神經(jīng)支配尿道外括約?。M紋肌）和盆底肌中的尾骨肌。陰部神經(jīng)切斷使尿道外括約肌失去了神經(jīng)支配，肌肉收縮受限，造成外括約肌功能下降或消失，導(dǎo)致尿道關(guān)閉壓下降。各實驗組大鼠的膀胱容量較正常對照組下降，但未出現(xiàn)持續(xù)漏尿、膀胱空虛現(xiàn)象，不合并真性尿失禁，只要腹壓增加時膀胱壓力能克服尿道平滑肌的阻力就能使尿液排出。

噴嚏實驗是檢測SUI造模成功與否的金標準。測定漏尿點壓從側(cè)面反映了實驗大鼠的儲尿能力[11]。Masson染色可以清楚顯示尿道周圍肌肉組織（紅色）和結(jié)締組織（綠色）的比例，同時反映尿道的整體改變。肌動蛋白是細肌絲的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白，與肌絲滑行直接相關(guān) ，肌動蛋白的減少標志著肌細胞的萎縮和退變[12]。S-100蛋白可以反映尿道周圍神經(jīng)分布變化。用免疫組化方法測定尿道周圍S-100蛋白和盆底肌α肌動蛋白進一步證實造模方式對實驗大鼠的影響。

本研究結(jié)果表明，實驗組的儲尿功能均較正常組有所下降，但Ⅲ、Ⅳ組儲尿功能下降較Ⅱ組更明顯，且在8周內(nèi)都能保持較低的漏尿點壓；并且組織學(xué)檢查可見Ⅲ、Ⅳ組的大鼠尿道全層變薄，結(jié)構(gòu)不明顯，肌層萎縮，尿道周圍神經(jīng)分布減少，Ⅳ組大鼠盆底肌的肌動蛋白含量較其他組有明顯下降。Ⅳ組噴嚏試驗陽性率為100%，可以說明Ⅳ組建立雌性SUI大鼠模型可行，并且該模型穩(wěn)定、成模率高，且同時增加損傷因素的種類，從原理上與人類SUI的發(fā)生機制更為接近。

[1]杜廣輝.女性尿道括約肌控尿和壓力性尿失禁發(fā)病的機制[J].臨床泌尿外科雜志,2007,22(4)：241-243.

[2] DamaserMS,Broxton KC,Ferguson C,etal.Functionaland neuroanatomical effects of vaginal distension and pudendal nerve crush in the female rat[J].J Urol,2003,170(3)：1027-1031.

[3] Cannon TW,Wojcik EM,Ferguson CL,et al.Effects of vaginal distension on urethral anatomy and function [J].BJU Int,2002,90(4)：403-407.

[4]Kuo HC.Effects of vaginal trauma and oophorectomy on the continence mechanism in rats[J].Urol Int,2002,69(1)：36-41.

[5]Stach LB,Hakala AL,Laippala P,et al.Severe depression determines quality of life in urinary incontinent woman [J].Neurourol Urodyn,2003,22(6)：563-568.

[6]鄧黎,梁志清.壓力性尿失禁動物模型的建立[J].重慶醫(yī)學(xué),2004,33(5)：680-681.

[7]Conway DA,Kamo I,Yoshimura N,et al.Comparison of leak point pressure methods in an animal model of stress urinary incontinence[J].Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct,2005,16(5)：359-363.

[8] Delancey JOL.Pathophysiology of adult urinary incontinence[J].Gastroenterology,2004,126(1)：S23-S32.

[9]Lang JH,Zhu L,Chen J,et al.Estrogen levels and estrogen receptors in patients with stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse[J].Int J Gynaecol Obstet,2003,80(1)：35-39.

[10]鄭捷,方祖軍,丁強.壓力性尿失禁與尿道周圍肌細胞凋亡的關(guān)系[J].上海交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2008,28(7)：779-781.

[11]Adekanmi OA,Freeman RM,Reed H,et al.Improving the diagnosis of genuine stress incontinence in symptomatic women with negative cough stress test：the distal urethral electical conductance test revisited[J].Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct,2003,14(1)：9-12.

[12]Awata JY,Kashiyama T,Ito K,et al.Some motile properties of fast characean myosin[J].Mol Biol,2003,326(3)：659-663.