姜黃素對人腎癌786-О細(xì)胞凋亡和侵襲的影響

劉 巖， 張春陽， 張大田， 姜華茂

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬一院泌尿外科，遼寧錦州121001)

姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃curcuma longa根莖中提取的一種酚性色素。其中醫(yī)性味歸經(jīng)屬辛、苦、溫。歸脾、肝經(jīng)，用于胸脅刺痛、閉經(jīng)、風(fēng)濕肩臂疼痛等［1］。姜黃的化學(xué)成分主要為姜黃素類及揮發(fā)油兩大類，此外尚有糖類、甾醇等。姜黃素類化合物(curcumins)是中藥姜黃的主要有效成分，含量約占3% ～6%，主要包括姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxy curcumin)和去二甲氧基姜黃素(bisde-methoxy curcumin)3種。晶體姜黃素為淡黃色粉末，含量≥90%，溶于乙醇、丙酮、乙二醇及堿性溶液;不溶于水、乙醚;微溶于植物油［2］。姜黃素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。Siddiqui等［3］在巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)用50 μM和100 μM姜黃素預(yù)處理的細(xì)胞比單純用脂多糖處理的細(xì)胞PPAR-γmRNA表達(dá)水平分別增加86%和125%，從體外實(shí)驗(yàn)表明姜黃素可通過上調(diào)PPAR-γ發(fā)揮抗炎作用。Kowluru［4］等研究顯示姜黃素能明顯阻止糖尿病導(dǎo)致的抗氧化能力減弱，延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展，其機(jī)制是姜黃素能抑制氧化DNA在視網(wǎng)膜的積聚和提高GSH水平。Punithavathi等［5］在胺碘酮誘導(dǎo)的動(dòng)物肺纖維化模型的研究中證實(shí)，應(yīng)用姜黃素對肺纖維化具有治療作用，姜黃素可降低肺纖維化模型大鼠支氣管肺泡灌洗液的細(xì)胞總數(shù)和蛋白總量，以及乳酸脫氫酶活性，抑制肺髓過氧化物酶的活性。Yuan HY等［6］研究發(fā)現(xiàn)在血管平滑肌細(xì)胞中，姜黃素能通過抑制膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1核轉(zhuǎn)位增加小凹蛋白-1的表達(dá)，從而阻止氧化修飾型LDL引起的膽固醇積聚。此外，姜黃素還可下調(diào)HIV相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制HIV患者B細(xì)胞淋巴瘤的增殖［7］。腎癌是泌尿系常見的惡性腫瘤，腎癌的發(fā)病率和死亡率均有上升趨勢，轉(zhuǎn)移性腎癌手術(shù)死亡率為2% ～11%［8］。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移影響著腫瘤患者的預(yù)后，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是治療腫瘤的重要靶點(diǎn)。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)研究姜黃素對腎癌細(xì)胞凋亡的影響和對腎癌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶MMP2、MMP9的表達(dá)效應(yīng)，研究其誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡及抗侵襲作用的可能機(jī)制，為腎癌的臨床藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及細(xì)胞株 姜黃素經(jīng)HPLC檢測，購自上海友思生物技術(shù)公司;786-О(人)腎透明細(xì)胞癌，購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞所。

1.1.2 主要化學(xué)試劑 鼠抗人MMP2/MMP9單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒，購自美國Roche公司。

1.1.3 主要儀器 美國BeckmanCoulter流式細(xì)胞儀，型號:EPICSFC500;BG-subMIDI多用途水平電泳儀，Baygene美國。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞分析 取對數(shù)生長期的786-О細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為5 ×106/mL，分別加入 5、10、20、40 μmol/L 不同濃度的姜黃素溶液，每個(gè)濃度3復(fù)孔，設(shè)不加任何藥物的對照組，培養(yǎng)48 h。流式細(xì)胞儀檢測、制片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 TUNEL技術(shù) 取對數(shù)生長期的786-О細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為5 ×106/mL，分別加入 5、10、20、40 μmol/L 不同濃度的姜黃素溶液，每個(gè)濃度3復(fù)孔，設(shè)不加任何藥物的對照組，培養(yǎng)48 h。取出載玻片，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加TUNEL混合反應(yīng)液50 μL(酶溶液與標(biāo)記溶液按照1∶9體積混合)，置濕盒37℃孵育60 min，同時(shí)以標(biāo)記溶液代替反應(yīng)溶液作為陰性對照滴加POD液50 μL，置濕盒37℃孵育30 min，滴加新鮮配制的DAB顯色液50 μL，中性樹膠封片。

1.2.3 DNA片段瓊脂糖凝膠電泳 取對數(shù)生長期的786-О細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為 5 ×106/mL，分別加入 5、10、20、40 μmol/L不同濃度的姜黃素溶液，每個(gè)濃度3復(fù)孔，設(shè)不加任何藥物的對照組，培養(yǎng)48h終止后，PBS洗2次，加入2 mL細(xì)胞裂解液(50 mmol/L tris·HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA，2%SDS和0.01%(w/v)蛋白酶K)，混勻，37℃水浴18 h后，再加入0.8 mL飽和NaCl溶液并37℃水浴5 min，經(jīng)3 000 r/min離心1 h后，取上清液加入RNA酶(20 mg/L)，37℃水浴15 min，用2倍體積無水乙醇-20℃過夜沉淀DNA，取2 μL在1.25%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 Western blot分析MMPs表達(dá) 取對數(shù)生長期的786-О 細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為 5 ×106/mL，分別加入 5、10、20、40 μmol/L不同濃度的姜黃素溶液，每個(gè)濃度3復(fù)孔，設(shè)不加任何藥物的對照組，培養(yǎng)24 h。按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南方法提取總蛋白，取10 μL樣品稀釋10倍后進(jìn)行蛋白定量，并統(tǒng)一調(diào)整樣品蛋白濃度為500 μg/mL，樣品分裝后-80℃保存?zhèn)溆?。配膠，點(diǎn)樣，電泳，轉(zhuǎn)膜(半干法轉(zhuǎn)移)，封閉，結(jié)合一抗，結(jié)合二抗，顯色:NBT/BCIP顯色，5～30 min，肉眼觀察出現(xiàn)特異性條帶顯藍(lán)黑色，反應(yīng)終止，用PBS終止反應(yīng)。應(yīng)用掃描軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。以鼠抗人β-actin(橫紋肌纖維和細(xì)胞細(xì)絲的蛋白質(zhì)組分)抗體作為一抗進(jìn)行Western blot檢測，作為判斷結(jié)果的內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 對細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞儀與TUNEL結(jié)果顯示:四個(gè)不同劑量之間凋亡率有顯著差異(P＜0.01)，見表1。

表1 不同濃度姜黃素對人腎癌786-О細(xì)胞凋亡率的影響(n=3，±s)

表1 不同濃度姜黃素對人腎癌786-О細(xì)胞凋亡率的影響(n=3，±s)

注:每個(gè)濃度組與前一個(gè)濃度組相比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

姜黃素含量/(μmol/L)凋亡率/%FCM TUNEL 0 6.52±0.42△△ 2.23±0.14△△10 8.46±0.45△△ 5.12±0.21△△20 10.21±0.50△△ 8.73±0.32△△40 12.37±0.55△△ 11.25±0.46 0.61±0.17 0.44±0.22 5△△

2.2 DNA片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析，20 μmol/L和40 μmol/L的姜黃素溶液處理得786-О細(xì)胞后可見凋亡特征性的DNA梯形條帶出現(xiàn)，隨濃度升高而更加清晰。表明姜黃素可使得在786-О細(xì)胞的核小體連接處的DNA隨機(jī)切斷，形成寡聚核小體。

2.3 Western blot結(jié)果 蛋白電泳條帶顯示，隨姜黃素濃度的逐漸增加，條帶的灰度逐漸降低。用目的條帶與內(nèi)參照條帶的比值代表目的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析，MMP2及MMP9組中各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 不同濃度姜黃素作用人腎癌786-О細(xì)胞后目的條帶與內(nèi)參照條帶比值(n=3，±s)

表2 不同濃度姜黃素作用人腎癌786-О細(xì)胞后目的條帶與內(nèi)參照條帶比值(n=3，±s)

注:每個(gè)濃度組與對照濃度組相比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;每個(gè)時(shí)間段與前一個(gè)時(shí)間段相比較，*P＜0.05。

姜黃素含量/(μmol/L)基質(zhì)金屬蛋白酶內(nèi)參照條帶比值/%MMP2 MMP9 0 83.23±4.21△* 78.29±10.79△*10 79.65±9.45△ 61.27±15.30△△*20 62.62±1.75△△* 42.55±2.13△△*40 54.43±13.97△△ 22.32±7.34 98.48±2.63 98.76±3.03 5△△*

3 討論

腎癌的主要治療方法是外科手術(shù)，對化療、放療、激素治療均不敏感。因此，探索新的治療方法和開發(fā)低毒而療效明顯的藥物已成為目前腎癌治療領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年研究表明，姜黃素對 HL-60、K562、SGC-7901、Bel-7402、MGC-803等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用［9-11］。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞凋亡減少有關(guān)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是藥物治療腫瘤最重要的機(jī)制之一［12］。本研究表明，姜黃素可誘導(dǎo)以人腎癌786-О細(xì)胞的凋亡，且呈濃度依賴性。DNA片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明姜黃素可使在786-О細(xì)胞的核小體連接處的DNA隨機(jī)切斷，形成寡聚核小體，誘導(dǎo)凋亡。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程十分復(fù)雜，這一過程主要包括了腫瘤細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與宿主之間、腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用。本實(shí)驗(yàn)中人腎癌786-O細(xì)胞在不同濃度姜黃素作用24 h后，蛋白電泳條帶顯示，隨姜黃素濃度的逐漸增加，MMP2及MMP9條帶的灰度逐漸降低。用目的條帶與內(nèi)參照條帶的比值代表目的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析，MMP9組中各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，姜黃素可以下調(diào)MMP9在人腎癌786-O細(xì)胞中的表達(dá)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。經(jīng)比較分析，也可以看出在MMP2組中MMP2在人腎癌786-O細(xì)胞中的下調(diào)表達(dá)的趨勢，且呈一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。由此可以得出初步結(jié)論，姜黃素可以下調(diào)基質(zhì)蛋白酶MMP9及MMP2的表達(dá)，起到抗腫瘤侵襲的作用。姜黃素具有抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移作用，有可能成為一種具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的藥物。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:186.

［2］盛柳青，嚴(yán)繼忠，梁萬根.姜黃素的研究進(jìn)展及應(yīng)用概況［J］.中國西部科技，2006，(4):14.

［3］Siddiqui A M，Cui X，Wu R，et al.The anti-inflammatory effect of curcumin in an experimentalmodelofsepsis ismediated by upregulation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma［J］.Crit Care Med，2006，34(7):1874-1882.

［4］Kowluru RA，Kanwar M.Effects of curcumin on retinal oxidative stress and inflammation in diabetes［J］.Nutr Metab(Lond)，2007，16(4):8.

［5］Punithavathi D，Venkatesan N，Babu M.Protective effects of curcumin against amiodarone-induced pulmonary fibrosis in rats［J］.Br J Pharmacol，2003，139(7):1342-1350.

［6］Yuan H Y，Kuang S Y，Zheng X，et al.Curcumin inhibits cellular cholesterol accumulation by regulating SREBP-1/caveolin-1 signalingpathway in vascular smooth muscle cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2008，29(5):555-563.

［7］葉 翩，張淑玲.姜黃素抗HIV的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］.國際中醫(yī)中藥雜志，2006，28(4):199-202.

［8］那彥群.中國泌尿外科疾病診斷治療指南［M］.2006:84.

［9］錢 潔，劉 特，賴冬梅，等.姜黃素對HL-60細(xì)胞的增殖抑制與凋亡誘導(dǎo)的影響［J］.中國生化藥物雜志，2008，29(5):308-311.

［10］Long S，Argyle DJ，Nixon C，et al.Telomerase reverse transcrip tase(TERT)expression and proliferation in canine brain tumours［J］.Neuropathol Appl Neurobiol，2006，32(6):662-673.

［11］Shammas M A，Koley H，Batchu R B，et al.Telomerase inhibition by siRNA causes senescence and apoptosis in Barrett’s adenocarcinoma cells:mechanism and therapeutic potential［J］.Mol Cancer，2005，15(4):24.

［12］Aghdassi A，Phillips P，Dudeja V，et al.Heat shock protein 70 increases tumorigenicity and inhibits apoptosis in pancreatic adenocarcinoma［J］.Cancer Res，2007，67(2):616-625.