紫外分光光度法測定生鮮乳中動物水解蛋白L－羥脯氨酸含量

孔曉鋒 古麗曼 達(dá)成彪 帕提曼

紫外分光光度法測定生鮮乳中動物水解蛋白L－羥脯氨酸含量

孔曉鋒 古麗曼 達(dá)成彪 帕提曼

采用紫外分光光度法測定生鮮乳中動物水解蛋白L-羥脯氨酸含量，結(jié)果表明，L-羥脯氨酸在 0.00～1.11 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 0）,在 100～300 μg/ml范圍內(nèi)平均回收率為98.7%，RSD=6.3%，因此，該法可用于生鮮乳中動物水解蛋白的鑒定，即L-羥脯氨酸的測定。

紫外分光光度法；動物水解蛋白；L-羥脯氨酸

皮革水解物是皮革“鞣革”工藝中產(chǎn)生的下腳料，是一種廉價的工藝原料，最常見的皮革水解物就是皮革粉。將其摻入牛奶或奶粉中可提高蛋白質(zhì)的含量，會導(dǎo)致不易消化，吸收利用率降低，影響人體健康。檢測牛奶中皮革水解物，實(shí)際就是檢測牛奶中的L-羥脯氨酸。L-羥脯氨酸，英文名L-Hydroxy proline,trans-4-Hydroxy-L-proline,別名：L-4-羥脯氨酸、反-4-羥基-L-脯氨酸，分子式為C5H9NO3,分子量為131.13。它是人體所需氨基酸，是膠原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，占正常膠原蛋白氨基酸總量的10%以上，是衡量機(jī)體膠原含量的一個重要指標(biāo)。牛奶中不含此氨基酸。檢測原理是生鮮乳經(jīng)過鹽酸水解，釋放出L-羥脯氨酸，經(jīng)氯胺T氧化，生成含有吡咯環(huán)的氧化物，用高氯酸破壞過量的氯胺T，終止氧化，含有吡咯環(huán)的氧化物與對甲氨基苯甲醛生成紅色化合物，在波長558 nm處進(jìn)行比色測定。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV-2401紫外分光光度計(jì)[島津儀器（蘇州）有限公司]、NDO-400定溫干燥箱（日本東京理化器械上海工廠）、BS 210S電子天平（北京賽多利斯公司）、DKS22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、奧立龍868酸度計(jì)（美國ORION公司），實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備。

1.2 試劑

所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.2.1 氫氧化鈉溶液

濃度為10 mol/l和1 mol/l。

1.2.2 緩沖溶液

將50 g檸檬酸、26.3 g氫氧化鈉和146.1 g結(jié)晶乙酸鈉溶于水，稀釋至1 L，此溶液與200 ml水和300 ml正丙醇混合。

1.2.3 氯胺T溶液

將1.41 g氯胺T溶于10 ml水中，依次加入10 ml正丙醇和80 ml緩沖溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 顯色劑

稱取10 g對二甲氨基苯甲醛，用35 ml高氯酸溶解，緩慢加入65 ml異丙醇。

1.2.5 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.2.5.1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 μg/ml）

精密稱取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，用少量0.02 mol/l鹽酸溶解并定容至100 ml容量瓶。

1.2.5.2 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（5 μg/ml）

精密量取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 ml，用少量0.02 mol/l鹽酸溶解并定容至100 ml容量瓶。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品前處理

稱取5 g生鮮乳樣品，精確至0.000 1 g,至20 ml水解管中，加入5.00 ml濃鹽酸（優(yōu)級純），滴加3滴50 g/l苯酚水溶液（新蒸餾的苯酚），氮吹，在氮吹的狀態(tài)下封口，在110℃水解24 h,取出冷卻，同時做空白試驗(yàn)。打開水解管，用濾紙過濾到100 ml容量瓶中，用蒸餾水反復(fù)沖洗濾紙和漏斗，定容。吸取10.00 ml的水解液于燒杯中，使用10 mol/l和1 mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8±0.2，用水定容至50 ml容量瓶，搖勻待測。

2.2 線性關(guān)系

2.2.1 吸取 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液 （5 μg/ml）0、10.00、20.00、30.00、40.00 ml，分別置于 100 ml容量瓶中，定容搖勻，濃度分別為 0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml。

2.2.2 取上述不同濃度的溶液5.00 ml，分別加入50 ml納氏比色管中，加入2.00 ml的氯胺T溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），搖勻后，室溫靜置20 min，再加入2.00 ml顯色劑，搖勻，濃度分別為 0、0.28、0.56、0.83、1.11 μg/ml，60℃水浴20 min。

2.2.3 迅速冷卻，在558 nm波長處測定吸光度，吸光度分別為 0.031、0.163、0.275、0.379、0.485A，以濃度 C為縱坐標(biāo)，吸光度A為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，線性范圍為 0～1.11 μg/ml，回歸方程為 C=2.459A-0.100，r=0.999 0。

2.3 樣品測定

取待測水解液5.00 ml，按照2.2.2、2.2.3進(jìn)行測定。

2.4 分析結(jié)果的測定

式中：X——樣品中L-羥脯氨酸的含量（g/100 g）；

C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的L-羥脯氨酸量（μg/ml）；

m——試樣的質(zhì)量（g）。

當(dāng)符合允許誤差所規(guī)定的要求時，取兩次測定結(jié)果的算數(shù)平均值作為結(jié)果，結(jié)果精確到0.01%。

同一分析者同時或相繼進(jìn)行的兩次測定結(jié)果之差不得超過平均值的5%。

2.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取6支20 ml水解管，每管均精密加入5 ml空白牛奶，取5 000 μg/ml L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液100、150、300 μl分別加入水解管中，制成 100、150、300 μg/ml濃度，按樣品測定方法測定回收率，結(jié)果見表1，由表1可以看出，本方法在100～300 μg/ml范圍內(nèi)，其加標(biāo)回收率在91.8%～106.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.3%，滿足用分光光度分析方法的試驗(yàn)要求。

表1 L-羥脯氨酸回收率（n=6）

2.6 精密度試驗(yàn)

取添加濃度為100 μg/ml樣品，按樣品測定方法重復(fù)測定6次，結(jié)果見表2。

表2 L-羥脯氨酸精密度試驗(yàn)

3 結(jié)論

該試驗(yàn)在生鮮乳中添加L-羥脯氨酸的濃度為100、150、300 μg/ml，測得 L-羥脯氨酸的回收率范圍為91.8%～106.8%，平均回收率為98.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.3%，方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果好，能滿足生鮮乳中動物水解蛋白的鑒定，即L-羥脯氨酸的測定。

4 注意環(huán)節(jié)

4.1 生鮮乳空白樣品中含有一定量的L-羥脯氨酸，可能是由檢測過程中使用的各種試劑引入，計(jì)算結(jié)果時要扣除空白。

4.2 試樣水解需在充滿氮?dú)鉅顟B(tài)下旋緊水解管蓋。

4.3 水解液過濾時不要漏液，使用蒸餾水,遵循少量多次原則，沖洗漏斗、濾紙。

4.4 試樣前處理過程調(diào)節(jié)pH值，應(yīng)先高濃度后低濃度，滴速不應(yīng)過快，控制pH值在8±0.2。

4.5 前處理過程需多次稀釋，注意稀釋倍數(shù)。

Assaying L-Hydroxyproline of derived animal hydroprotein in raw milk by ultraviolet spectrophotometry

Kong Xiaofeng,Gu Liman,Da Chengbiao,Pa Timan

L-Hydroxyproline has good linear relationship in scope of 0.00～1.11 μg/ml by ultraviolet spectrophotometry with its correlation coefficient（r）of 0.999 0 and its averaged recovery is 98.7%in scope of 100～300 μg/ml,RSD=6.3%.The result testifyed that the method can assay L-Hydroxyproline of derived animal hydroprotein in raw milk.

ultraviolet spectrophotometry；derived animal hydroprotein；L-Hydroxyproline

S 816.17

A

1001-991X（2011）04-0060-02

孔曉鋒，新疆獸藥飼料監(jiān)察所，830063，烏魯木齊市南湖西路37號。

古麗曼、達(dá)成彪、帕提曼，單位及通訊地址同第一作者。

2010-10-08

（編輯：高 雁，snowyan78@163.com）