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    左旋卡尼汀后處理聯(lián)合預(yù)處理對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷作用的研究*

    2011-01-24 01:06:38鮑文韜楊蘇民
    關(guān)鍵詞:卡尼汀左旋后處理

    鮑文韜 楊蘇民

    (1. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266021; 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院呼吸重癥科, 山東 泰安 271000)

    隨著心臟科醫(yī)師手術(shù)及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療( PCI) 的廣泛開展,缺血再灌注損傷成為臨床中必須面對的難題。在早期心外科手術(shù)中,通過改變再灌注的條件和狀態(tài)來預(yù)防再灌注損傷,如再灌注時的壓力、灌注液的溫度和成分等。1986 年,Murry等[1-2]首次提出缺血預(yù)處理(IPC)的概念,并且經(jīng)研究證實在離體模型和活體動物中均有心臟保護作用。我國學(xué)者高峰、趙志清等[3-4]提出了缺氧后處理的概念和經(jīng)典的缺血后處理(IPo) 概念,并用實驗證實IPo與IPc對再灌注后心肌具有類似的保護效果,是機體另一種內(nèi)源性抗再灌注損傷的保護措施。但在臨床上由于不易操作等原因,機械后處理無法廣泛使用。左旋卡尼汀是已經(jīng)應(yīng)用于臨床的藥物,它對缺血心肌有多重保護作用,特別是能促進再灌注期糖的有氧氧化,調(diào)節(jié)糖、脂肪酸氧化的平衡,改善心肌的能量代謝。缺血心肌常伴有卡尼汀含量的不足,因此對缺血心肌而言,左旋卡尼汀就顯得尤為重要,在臨床應(yīng)用中有著較為廣闊的前景。本研究探討在心臟離體情況下, 應(yīng)用左旋卡尼汀預(yù)處理聯(lián)合后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響, 為臨床心肌缺血性疾病的保護和治療提供基礎(chǔ)的研究資料。

    1 材料與方法

    1.1材料 雄性Wistar大鼠40只,體重250~300 g,購于泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(許可證號SCXK魯20050015))。左旋卡尼汀(L-CN)注射液由常州蘭陵制藥有限公司生產(chǎn)(5 ml/g,批號為0003271)。CK、LDH 試劑盒購自南京建成生物工程研究所,氯化三苯基四氮唑(TTC)購自上?;瘜W(xué)試劑公司,余試劑及設(shè)備由泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院中心實驗室提供。

    1.2動物模型制備 動物3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。肝素鈉(3 mg/kg)充分肝素化1 min后迅速開胸,取出心臟,置于4℃的K-H液中簡單修剪多余的血管及脂肪組織。打開Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng),調(diào)整流量至15 ml/min,充分排氣后將灌注管道插入主動脈,保證灌注管道開口插入主動脈深度不超過主動脈瓣口,打結(jié)固定,開始灌注。行逆行主動脈恒溫恒壓灌注,溫度控制在(37±0.2)℃,pH 7.35~7.45,灌注壓75 cmH2O,并于灌注過程中持續(xù)通入95%O2和5%CO2混合氣體。在肺動脈圓錐處剪一小口,使冠脈流出液自然流出。以左冠狀動脈主干( LAD)為標(biāo)志,在左心耳根部下緣約2 mm處,在冠狀動脈前降支根部穿一細(xì)結(jié)扎線,在肺動脈圓錐旁穿出,結(jié)扎時采用直徑 0.2 cm細(xì)塑料管穿過結(jié)扎線,收緊或松開結(jié)扎線以造成心肌缺血再灌注模型。在該結(jié)扎線下方約 0.5 cm處再穿一結(jié)扎線,以備結(jié)扎。心肌功能測量:剪開左心房經(jīng)二尖瓣置一聚乙烯球囊于左心室內(nèi),通過導(dǎo)管和 BL-420E+生物機能儀連接,向球囊內(nèi)注入適量生理鹽水使左室舒張末壓( LVEDP)為 5~10 mmHg,并維持實驗始終。避免球囊內(nèi)混有氣泡。選擇心臟標(biāo)準(zhǔn): 平衡灌注末HR> 160次/min, LVSP>75 mmHg,每分鐘室性早搏< 2個,不符合上述標(biāo)準(zhǔn)者舍棄后另補充。

    1.3實驗分組 (1)對照組( Con): 平穩(wěn)灌流15 min后,左冠狀動脈前降支(LAD)阻斷45 min, 復(fù)灌120 min;(2) 缺血后處理組(IPo): 在復(fù)灌開始,LAD給予6次短暫開放/鉗夾(開/夾各10秒);(3)藥物后處理組(LIPO): L-CN 10 mol/L于復(fù)灌時給予10 min;(4)藥物預(yù)處理組(LIPc): 在LAD阻斷前先給予10 min的L-CN;(5)聯(lián)合處理組(LIPP): LAD阻斷前后分別給予10 min的L-CN。

    1.4觀測指標(biāo) 收集再灌注30、60、120 min時冠脈流出液量(收集3 min冠脈流出液取平均值,CF),液氮罐內(nèi)保存,實驗結(jié)束后整批測量再灌注60 min時LDH及CK水平。再灌注 2 h結(jié)束后,再次原位結(jié)扎左冠狀動脈前降支,從主動脈根部灌注1% Evans藍(lán)溶液約2 ml左右。非缺血區(qū)藍(lán)染后,用冰凍生理鹽水沖洗,之后凍于-20℃冰箱。30 min后用吉列刮胡刀片垂直于心臟長軸將其切成1~2 mm厚的薄片,置于1%TTC(pH 7.4)PBS溶液中,37℃避光孵育15~30 min后置于10%的甲醛溶液過夜。次日,將已染色的心肌薄片用濾紙吸干后按序放置于平板上,其中正常的非缺血心肌組織被Evans藍(lán)染為藍(lán)色,有缺血危險但未梗死的心肌組織被TTC染為紅色,梗死區(qū)呈灰白色,分離后分別稱重,梗死范圍以梗死心肌重量與缺血心肌重量之比表示。

    2 結(jié) 果

    2.1灌注前及平穩(wěn)灌流復(fù)灌后60 min時CK及LDH比較 CK及LDH在缺血再灌注前各組之間無明顯差異。再灌注60 min后,與Con組比較,CK值在IPo、LIPo、LIPc和LIPP組顯著降低,說明單純機械后處理及藥物預(yù)處理、后處理具有明顯的心肌保護作用。IPo、LIPo、LIPc和LIPP各組間心肌保護作用無明顯差異。與Con組比較,在灌注60 min后LDH 在LIPo、LIPc、LIPP組顯著下降,而后三組之間無明顯差異,說明預(yù)處理、后處理及聯(lián)合處理對心臟LDH影響無明顯差異。見表1。

    2.2各時間點CF的比較 各組在灌注前基礎(chǔ)值無明顯差別,復(fù)灌30 min、60 min后Con 同IPo、LIPo、LIPc及LIPP組相比均具有明顯差異。復(fù)灌到120 min時,LIPo組CF值與其他各組相比P<0.05,說明LIPo可能較其它處理組具有更長的改善冠脈流量的作用。見表2。

    2.3各時間點HR的比較 在灌注開始前各組心率無明顯差異。而再灌注60 mim時,其他各處理組與Con相比P均<0.05,各處理組之間無明顯差異。見表3。

    表1 灌注前及再灌注60 min 時CK 及LDH比較

    注:與Con比較,aP<0.05,bP<0.01。

    表2 平穩(wěn)后及復(fù)灌各時間點CF比較

    注:與Con比較,*P<0.05; 與LIPo比較,#P<0.05。

    表3 平穩(wěn)后及復(fù)灌各時間點HR比較(次/分)

    注:與Con比較,aP<0.05。

    2.4各組在心肌風(fēng)險區(qū)范圍比較 再灌注結(jié)束,行心肌梗死測定表明,各組在心肌風(fēng)險區(qū)范圍比較無明顯差異。LIPo 組心肌梗死區(qū)重量從(34.39±1.62)%下降到(28.02±3.10)%(P<0.05), LIPo、LIPc及LIPP之間無明顯差異。

    3 討 論

    缺血再灌注損傷日益引起臨床醫(yī)師們的關(guān)注,其損傷的重要因素可能與鈣離子超載、氧自由基和中性粒細(xì)胞聚集等因素[5-6]有關(guān),也與心肌細(xì)胞的能量產(chǎn)生及利用障礙緊密相關(guān)。左旋卡尼汀是已用于臨床的藥物,它對缺血心肌有多重保護作用,其保護缺血心肌的作用機制可能主要為:通過減少缺血期長鏈脂酰肉堿(LCAC) 的堆積減輕了LCAC 對心肌的毒性作用;保護血管內(nèi)皮細(xì)胞,保障心臟的血液供應(yīng);左旋卡尼汀能增強心肌清除自由基的能力,阻止氧化應(yīng)激造成的心肌細(xì)胞損傷等。

    本實驗中左旋卡尼汀預(yù)處理、后處理及聯(lián)合處理的冠脈流量和對照組相比具有顯著改變,其中左旋卡尼汀后處理組,120 min后冠脈流量與對照組有顯著性差異,說明左旋卡尼汀后處理能有效的保護血管內(nèi)皮細(xì)胞,擴張冠脈,增加冠脈流量。而隨著時間的延長,機械預(yù)處理、藥物預(yù)處理及聯(lián)合處理冠脈保護作用明顯較左旋卡尼汀后處理組減弱,其具體原因及機制需進一步研究。而除對照組外,其余各組之間對CK和LDH的影響無明顯差異。說明各組均有心肌保護作用,但預(yù)處理結(jié)合后處理無明顯的保護疊加作用。同時,左旋卡尼汀預(yù)處理、后處理可以明顯改善缺血再灌注后心肌梗死的發(fā)生率。

    總之,左旋卡尼汀對心肌缺血-再灌注損傷有保護作用,能進一步改善心肌細(xì)胞的能量代謝和缺血-再灌注心肌的心功能,增加冠狀動脈的血流量,減輕心肌細(xì)胞的損傷,對心肌缺血-再灌注損傷有保護作用,為左旋卡尼汀應(yīng)用臨床提供了理論基礎(chǔ)。

    [1] Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia; a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J]. Circulation,1986,74 (5):1124-1136.

    [2] Murry CE, Richard VJ, Reimer KA, et al. Ischemic preconditioning slows energy metabolism and delays ultrastructural damage during a sustained ischemic episode[J]. Circ Res, 1990, 66(4): 913-931.

    [3] 高峰,Yan WL ,Geng YJ,等.“缺氧后處理”對大鼠缺氧-復(fù)氧心室肌細(xì)胞的保護作用[J]. 心功能雜志, 1999, 11(4): 241-242.

    [4] Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison wit h ischemic preconditioning[J]. Am J Physiol(Heart Circ Physiol), 2003, 285 (2): 579-588.

    [5] 劉秀華. 鈉鈣交換體與心肌缺血再灌注[J].中國動脈硬化雜志, 2005, 13(2): 233-235.

    [6] Salie R, Harper I, Cillie C, et al. Melatonin protects against ischemic reperfusion myocardial damage [J]. J Mol Cell Cardial, 2001, 33: 343-357.

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