空腸彎曲菌外膜蛋白rOMP18的克隆表達(dá)及抗原性分析＊

喬 博,孟凡亮,顧一心,何利華,張 姝,肖 迪,劉國(guó)棟,曹芳芳,張建中,張茂俊

空腸彎曲菌(Campylobacter jej uni,C.jej uni)屬于嗜熱微需氧革蘭氏陰性彎曲菌,是引起人類急性腹瀉常見(jiàn)的病原體之一[1]。在許多國(guó)家的腹瀉患者中所占的比重已居首位,部分國(guó)家亦僅次于沙門菌或志賀菌。發(fā)展中國(guó)家空腸彎曲菌的感染率明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家,通常為發(fā)達(dá)國(guó)家的10～100倍[2]。除腸炎外,其研究證明空腸彎曲菌中某些菌株的感染還與格林-巴利綜合征(Guillain-BarréSyndrome,GBS)的發(fā)生有關(guān)[3]。

血清抗體的檢測(cè)結(jié)果通常不作為空腸彎曲菌感染的診斷依據(jù),但患者針對(duì)空腸彎曲菌抗體滴度的變化對(duì)于分析空腸彎曲菌感染后導(dǎo)致 GBS的病因分析具有重要意義[4]。目前空腸彎曲菌血清抗體檢測(cè)試劑缺乏,為獲得檢測(cè)空腸彎曲菌抗體的特異診斷抗原,本研究擬對(duì)空腸彎曲菌外膜蛋白18(outer membrane protein 18,簡(jiǎn)稱 OMP18)進(jìn)行克隆表達(dá),并進(jìn)一步檢測(cè)其抗原性。

OMP18是由空腸彎曲菌omp18基因編碼的分子質(zhì)量為18kD的外膜蛋白,該蛋白在彎曲菌屬中普遍存在,在同一個(gè)彎曲菌種內(nèi)又高度保守。因此OMP18抗原性評(píng)價(jià)對(duì)于空腸彎曲菌感染血清學(xué)診斷候選抗原的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 空腸彎曲菌(ICDCJ07001由本科室分離保存);表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)(Merk公司)和菌株E.coliBL21(DE3)(天根公司);Ex Taq酶,限制性內(nèi)切酶B amH I和XhoI,T4 DNA連接酶,(TaKaRa公司);瓊脂糖凝膠切膠回收試劑盒,質(zhì)粒小提試劑盒(天根公司);IDA His-Bind預(yù)裝純化柱(Novagen公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 rSPA(北京博奧森生物技術(shù)公司);兔免疫血清(本科室)。

1.2 方法

1.2.1omp18的保守性分析在NCBI上下載已測(cè)序的omp18基因序列及其編碼的氨基酸序列,分別為 C8J_0106、JJD26997_0120、CJ E0108、CJJ81176_0148、CJ0113、ICDCCJ07001_106。運(yùn)用 Vector NTI Suite 6分析其保守性。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 運(yùn)用Swiss-Prot(http://www.expasy.ch/sprot/)預(yù)測(cè)OMP18蛋白的信號(hào)肽,Primer 5.0設(shè)計(jì)OMP18去掉信號(hào)肽后對(duì)應(yīng)基因的引物。上游引物:5′-B amHⅠCGCGGA TCC TGTAGCACAAAAA GCACTAGCGTA;下游引物:5′-X hoⅠCCGCTCGAG TCTTGA TAATTTAAATTCAGCACG,該引物由上海生工公司合成。PCR 擴(kuò)增體系為50μl:10×buffer 5μL,dNTP 1μL,ICDCCJ07001 DNA(模板)2μL,上、下游引物各1.25μL(20μmol/L),Ex Taq 酶 (5U/μL)0.5μL,ddH2O 39μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃,預(yù)變性5min,然后按以下參數(shù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94℃變性30s,58℃退火 30s,72℃延伸 2min,最后 72℃延伸10min,4℃保存。取 PCR產(chǎn)物50μL,1.5%的瓊脂糖凝膠(0.01‰GelRed染色),80V電泳50min,在凝膠電泳成像儀下切膠。

1.2.3 pET32a-om p18重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將瓊脂糖凝膠切膠回收的omp18 PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32a(+)分別用B amHⅠ和X hoⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切體系為30μL:10×K buffer 3μL,PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pET32a(+)各 18μL,B amH Ⅰ與XhoⅠ各1.5μL,ddH2O 6μL。30℃酶切 1h,37℃酶切 2h。酶切產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖切膠回收。omp18和pET32a(+)以摩爾比3∶1的比例混合加入 T4連接酶16℃過(guò)夜連接。取連接產(chǎn)物5μL轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含氨芐青霉素(AMP100μg/mL)的 LB平板上,37℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑選單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,180r/min過(guò)夜孵育,質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,進(jìn)行單、雙酶切鑒定,陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pET32a-omp18。

1.2.4 OMP18的誘導(dǎo)表達(dá)、存在狀態(tài)分析及純化將陽(yáng)性克隆子菌落接種到5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200r/min搖至菌液濃度OD約為0.8～1.0時(shí)加入終濃度為1mmol/L的IPTG,30℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。于兩個(gè)離心管內(nèi)分別吸取菌液樣品各1mL,0.01 mol/L的PBS洗菌兩遍,其中一管加入終濃度為1×SDS-PAGE上樣緩沖液,100℃水浴5min,12 000g離心5min,取上清用于表達(dá)產(chǎn)物分析。另一管超聲破碎菌體分離上清和沉淀,上清中加入終濃度為1×SDS-PAGE上樣緩沖液,沉淀先以30μL生理鹽水懸浮混勻,再加入終濃度為1×SDS-PAGE上樣緩沖液,這兩樣品用于分析重組蛋白的存在狀態(tài)。將上述樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳分析,5%濃縮膠和12%分離膠電泳,考馬斯亮藍(lán)R250染色。OMP18純化采用的是 IDA His-Bind預(yù)裝純化柱,按其說(shuō)明書操作。

1.2.4 Western-blot分析 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳后將凝膠,濾紙,PVDF膜置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡活化30min后,至半干式電轉(zhuǎn)印儀25V轉(zhuǎn)印60min,用含0.1%Tween20的 TBS(TBST)洗膜5次,每次5min,然后轉(zhuǎn)入封閉液(1×PBS+0.5%脫脂奶粉)中,4℃封閉過(guò)夜;取出 PVDF膜,用 TBST洗膜5次,每次5min;加入1∶50一抗反應(yīng)液(空腸彎曲菌免疫前、后兔血清)37℃緩慢搖動(dòng)孵育60min;取出PVDF膜用 TBST洗膜 5次,每次 5min;加入1∶40 000二抗反應(yīng)液(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記rSPA)37℃緩慢搖動(dòng)孵育60min;洗膜后加入DAB(6mgDAB、10uL H2O2、1×PBS稀釋至10mL)顯色后用蒸餾水終止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1omp18基因測(cè)序菌株DNA保守性分析

2.1.1om p18基因的保守性分析以om p18基因前200bp為例,顯示omp18基因及其編碼的氨基酸序列具有高度保守性,見(jiàn)圖1。

2.1.2omp18編碼氨基酸的保守性分析 見(jiàn)圖2

2.2 PCR擴(kuò)增om p18及重組質(zhì)粒的酶切鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物在444bp左右(圖3)。將重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)B amHⅠ和X hoⅠ單、雙酶切后在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳(圖4),獲得預(yù)期大小的基因片段,表明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 omp18(1-200bp)DNA序列比對(duì)分析Fig.1 Comparison of DNA sequence foromp18(1-200bp)inC.jej uni

圖2 OMP18氨基酸序列比對(duì)分析Fig.2 Comparison of amino acid sequence forOMP18 in C.jejuni

圖3 omp18基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Results of PCR product ofomp18 1.DNA markerⅤ;2.PCR product ofomp18

2.3 rOMP18存在狀態(tài)分析及純化表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果參見(jiàn)圖5,從圖中可看出誘導(dǎo)后的pET32a-omp18有表達(dá),該蛋白以包涵體形式存在,沉淀經(jīng)8mol/L尿素溶解后用 His純化柱純化得到較高純度的重組rOMP18蛋白,該重組蛋白是與純化標(biāo)簽 HIS結(jié)合的融合蛋白,分子量為34kD(HIS16kD)左右。

2.4 Western-blot分析 Western-blot結(jié)果見(jiàn)圖6,rOMP18蛋白對(duì)空腸彎曲菌免疫兔血清有較好的抗原性(圖中第8條帶)。

3 討 論

外膜蛋白通常是病原細(xì)菌的疫苗成分以及特異診斷抗原的候選蛋白。鞭毛蛋白A(flagellin A,FLA),外膜蛋白 PEB1(periplasmic solute-binding protein 1,PEB1),外膜蛋白 PEB3(periplasmic solute-binding protein 3,PEB3)已被證實(shí)其在空腸彎曲菌中的抗原性[9],但是FLA蛋白抗原性的多變與其f la基因型多變是一致的[7-8]。而且空腸彎曲菌有很多蛋白是受溫度調(diào)控的蛋白。因此尋找一個(gè)抗原性穩(wěn)定的蛋白對(duì)空腸彎曲菌的免疫學(xué)診斷具有重要的意義。

圖4 pET32a-omp18重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.4 Results of recombinant plasmid pET32a-omp18 ested by endoenzymes1.DNA MarkerⅢ;2.pET32a-omp18 esterd by Bam HⅠandXhoⅠ;3.pET32a-omp18 esterd by Bam HⅠ

圖5 轉(zhuǎn)化體BL21-OMP18表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGEandlysis for BL21-OMP181.protein molecular weight standard;2.rOMP18 before induction in BL21;3.rOMP18 after induction in BL21;4.precipitation in BL21;s5.upermatant in BL21;6.purified products of rOMP18

圖6 rOMP18的Western-blot分析Fig.6 Western blot analysis of products of rOMP18 1,5.protein molecular weight standard;2-6 protein of ICDCCJ07001;3,7.protein ofMycobacterium tuberculosis;4,8.purified products of OMP18

omp18在空腸彎曲菌內(nèi)是單拷貝基因,長(zhǎng)498bp,其中(G+C)約為 33.5%,編碼 165個(gè)氨基酸。Vector NTI Suite 6分析顯示omp18也是保守基因,Andre B[9]等人用該基因的引物擴(kuò)增了從不同宿主(人、狗、雞等)體內(nèi)分離到的空腸彎曲菌都能得到陽(yáng)性的擴(kuò)增條帶,又用southern-blot驗(yàn)證了彎曲菌中空腸彎曲菌(C.jejuni)、結(jié)腸彎曲菌(C.coli)、胎兒彎曲菌(C.lari)、烏普薩拉彎曲菌(C.upsaliensis)、瑞士彎曲菌(C.helveticus)omp18基因的普遍性并具有相似性。

OMP18蛋白屬于細(xì)菌的PALs(peptidoglycanassociated lipoproteins)蛋白家族,PALs在細(xì)胞外膜與肽聚糖之間起橋聯(lián)作用參與細(xì)胞壁的構(gòu)成并保持其完整性[10]。OMP18蛋白在空腸彎曲菌內(nèi)普遍存在,分子量大小為18kD,其 N端的前18個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽,指導(dǎo)OMP18蛋白定位在空腸彎曲菌的表面[4]。與空腸彎曲菌OMP18蛋白相似相似的外膜蛋白有:流感嗜血桿菌(Haemophilus inf luenzae)的外膜蛋白PAL(P6)有36%的氨基酸序列相似[11],與大腸桿菌(Escherichia coli)的 PAL蛋白有32%的氨基酸序列相似[12],但用空腸彎曲菌制備的OMP18單克隆抗體驗(yàn)證了其能與所有彎曲菌的OMP18蛋白結(jié)合與幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌等無(wú)非特異性反應(yīng)[9]。本研究建立的用pET32a(+)載體表達(dá) ICDCCJ07001的OMP18蛋白是去掉信號(hào)肽后,其N端與載體上6個(gè)連續(xù)的組氨酸標(biāo)簽相連接的融合蛋白,并且pET32a(+)的組氨酸標(biāo)簽為后續(xù)的純化工作提供了便利。Western-blot檢測(cè)rOMP18蛋白能與空腸彎曲菌免疫兔血清結(jié)合,證明該重組蛋白具有抗原性。本研究所用的一抗是三組抗體包括了不同血清型的空腸彎曲菌菌株,分別為 GBS爆發(fā)株、GBS散發(fā)株、腹瀉株。ICDCCJ07001是2007年導(dǎo)致我國(guó)長(zhǎng)春發(fā)生GBS暴發(fā)的空腸彎曲菌,用此菌株做為克隆表達(dá)的模板可以初步驗(yàn)證OMP18蛋白在我國(guó)臨床標(biāo)本中的抗原性,為以后大量標(biāo)本的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

本研究成功構(gòu)建了空腸彎曲菌rOMP18基因的原核表達(dá)系統(tǒng),并分析了表達(dá)產(chǎn)物的抗原性,為空腸彎曲菌血清學(xué)診斷提供了候選抗原。

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