歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌的分離鑒定*

陳 強(qiáng),龔 暉,楊金先

遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)隸屬腸桿菌科,愛德華氏菌屬,是導(dǎo)致人獸共患病的一種常見病原菌,其流行區(qū)域廣,宿主種類多,對養(yǎng)殖業(yè)特別是鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生巨大的影響。1962年Hoshina[1]首次報(bào)道該菌與日本鰻(Anguilla japonica)紅病有關(guān)。隨后,國內(nèi)許多學(xué)者開始對鰻鱺愛德華氏菌進(jìn)行了相關(guān)的研究。韓先樸等[2]從福建日本鰻體內(nèi)分離到“福建愛德華氏菌”。王國良等[3]從浙江日本鰻體內(nèi)分離到“浙江愛德華氏菌”。盧全章等[4]認(rèn)為引起廣東省日本鰻肝腎病的病原是遲鈍愛德華氏菌和運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌;董傳甫等[5]發(fā)現(xiàn)引起日本鰻敗血腹水病的病原菌除了遲鈍愛德華氏菌,還有溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)。余露軍等[6]從患病日本鰻體內(nèi)分別檢測到遲鈍愛德華氏菌和創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)。因此,病原菌的鑒定是鰻鱺疾病確診的關(guān)鍵。但目前未見對歐洲鰻(Anguilla anguilla)遲鈍愛德華氏菌進(jìn)行分離鑒定的報(bào)道。本試驗(yàn)采用病原菌分離培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察、生化特性鑒定、16SrDNA序列分析和屬特異性PCR技術(shù)對歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌進(jìn)行鑒定,以期為歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌的快速確診、人獸共患病的研究和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 API 20E細(xì)菌鑒定試劑盒,購自法國生物梅里埃公司;DNTP、TaqDNA聚合酶購自Takara。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng) 2008年11月至2009年1月,福建長樂某歐洲鰻養(yǎng)殖場部分養(yǎng)殖池內(nèi)泡沫增多,病鰻頭腹朝天,行單鰓呼吸。其皮膚和鰭條有明顯的出血點(diǎn),前胸部腫大,腹壁出現(xiàn)穿孔。腹腔內(nèi)含渾濁液體,肝臟腫大,形成數(shù)個(gè)大小不等的化膿病灶。肝區(qū)腹腔內(nèi)壁軟化,內(nèi)膜穿孔,并有大量的出血點(diǎn)。部分病死鰻肛門紅腫,消化道無肉眼可見的病變。無菌條件下取病鰻的肝組織劃線接種于胰胨大豆瓊脂(TSA)平板,25℃培養(yǎng)24～48h,分離出病原菌。挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),觀察細(xì)菌生長情況和菌落特征,然后對單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢細(xì)菌形態(tài)。

1.3 病原菌的人工感染試驗(yàn) 將35尾健康的歐洲鰻(平均體質(zhì)量 15g),隨機(jī)分成 5組,分別置于60cm×50cm×40cm水族箱中。純培養(yǎng)菌按1%的比例接種于營養(yǎng)肉湯,25℃培養(yǎng)24h,活菌計(jì)數(shù)后用PBS稀釋成一定的濃度,每組按每克體重1×104、1×105、1×106、1×107cfu/m l的濃度腹腔注射歐洲鰻,劑量為0.1m L。對照組注射PBS。試驗(yàn)期間水溫為17～18℃,充氧,每日換水 50%,及時(shí)清除并記錄各組鰻鱺的死亡數(shù)量。連續(xù)觀察15d,直至無新增死亡為止。用SPSS 13.0軟件采用概率單位法進(jìn)行半數(shù)致死量(LD50)的計(jì)算[7]。

1.4 病原菌的生化特性鑒定 取純培養(yǎng)菌,按API 20E細(xì)菌鑒定試劑盒的操作步驟進(jìn)行硝酸鹽還原、氧化酶、阿拉伯糖、苦杏仁苷、蜜二糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、葡萄糖、明膠酶、V-P反應(yīng)、吲哚產(chǎn)生、色氨酸脫氨酶、脲酶、H2S產(chǎn)生、檸檬酸利用、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、β-半乳糖苷酶的生化特性測定。

1.5 病原菌的16SrDNA鑒定 將純培養(yǎng)菌接種于營養(yǎng)肉湯,25℃培養(yǎng)24h,離心后收集菌體,按煮沸法提取模板DNA。參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物P1和P2(見表1)。引物由上海生工公司合成。PCR擴(kuò)增按常規(guī)方法進(jìn)行,反應(yīng)體積 20μl,其中 10×buffer2.0μL,1.5mmol/LMgCl2 1.6μL,10mmol/L 4×DNTP 0.4μL,引物 P1、P2 各 0.2μL,2.5U/μL TaqDNA 聚 合酶 0.2μL,模 板 DNA l.0μL,用ddH2 O補(bǔ)至 20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?96℃預(yù)變性6min,95℃變性1min,55℃復(fù)性1min,72℃延伸2min,30個(gè)循環(huán)后72℃溫育5min。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司測序。接著采用NCBI的BLAST軟件查詢所測菌株的16SrDNA序列的屬性,將其與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的同屬菌的16S rDNA基因,進(jìn)行同源性序列比對分析,然后構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 病原菌的特異性PCR鑒定 參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)4對擴(kuò)增引物P3～P10(見表1),對應(yīng)致病性愛德華氏菌屬的鞭毛蛋白基因簇。PCR擴(kuò)增方法參照1.5,其中復(fù)性退火溫度見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 病原菌生長較緩慢,在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后菌落為針尖大小,48h后形成圓形光滑、半透明的灰白色小菌落。革蘭氏陰性桿菌,菌體直、單個(gè)。將病原菌編號為ET81126。

2.2 病原菌的人工感染試驗(yàn) 在為期15d的感染試驗(yàn)中,劑量為1×106cfu/g試驗(yàn)組在第5d全部死亡;1×105cfu/g試驗(yàn)組在第8d共死了6尾;1×104cfu/g試驗(yàn)組從第9d開始出現(xiàn)死亡,到第14d共死了3尾。試驗(yàn)過程中,大部分魚在死亡前后出現(xiàn)了比較明顯的肝臟型癥狀,與養(yǎng)殖場中發(fā)現(xiàn)的病鰻癥狀基本一致。而1×103cfu/g試驗(yàn)組和對照組的歐洲鰻活動(dòng)正常,外觀無明顯改變。利用SPSS軟件算得半數(shù)致死量(LD50)為4.55×104cfu/g(見表2)。

表1 試驗(yàn)所用的PCR引物Tab.1 PCR primers used in this experiment

表2 菌株ET81126對歐洲鰻的致病性試驗(yàn)Tab.2 The pathogenicity of strain ET81126 to European eel

2.3 病原菌的生化特性鑒定 菌株81126的生化特性鑒定見表3,除了甘露醇、阿拉伯糖陽性外,其它均與陳翠珍[10]對遲鈍愛德華氏菌的描述相同,可初步判斷分離菌為愛德華氏菌。硝酸鹽還原、氧化酶、阿拉伯糖、苦杏仁苷、蜜二糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、葡萄糖、明膠酶、V-P反應(yīng)、吲哚產(chǎn)生、色氨酸脫氨酶、脲酶、H2S產(chǎn)生、檸檬酸利用、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、β-半乳糖苷酶的生化特性測定。

2.4 病原菌的16SrDNA鑒定 菌株ET81126經(jīng)PCR擴(kuò)增所獲得的16SrDNA基因部分序列長度為1508bp。在GenBank中進(jìn)行16SrDNA基因同源性序列檢索,結(jié)果顯示菌株ET81126的序列與愛德華氏菌的同源率為97%～99%。后選擇同源率為99%的5株細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果顯示菌株ET81126與遲鈍愛德華氏菌(登錄號EF467289)自然聚為1支。綜合生化指標(biāo)和16SrDNA基因序列分析結(jié)果,可將菌株ET81126鑒定為遲鈍愛德華氏菌。

2.5 病原菌的特異性PCR鑒定結(jié)果 菌株ET81126經(jīng)特異性PCR擴(kuò)增和凝膠電泳,結(jié)果顯示:引物 P3/P4和 P9/P10分別出現(xiàn) 848bp和230bp的DNA片段,其它2對引物無擴(kuò)增條帶(圖1)。進(jìn)一步證實(shí)菌株ET81126為遲鈍愛德華氏菌非典型菌株(E.tarda A typical)。

3 討 論

遲鈍愛德華氏菌可感染日本鰻生長的整個(gè)階段,特別是早期(如白仔鰻、黑仔鰻、幼鰻),死亡率更高。其原因可能是日本鰻對遲鈍愛德華氏菌較敏感,但歐洲鰻對該菌的抗性較強(qiáng),一般只在白仔或黑仔階段發(fā)生輕度感染,且常常分離不到致病菌,因此,對歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌病的報(bào)道較少。本試驗(yàn)從患典型“肝臟膿腫”的越冬成鰻中分離到遲鈍愛德華氏菌菌株ET81126,通過人工感染試驗(yàn)證實(shí)菌株ET81126對歐洲鰻具有高度的致病性,半數(shù)致死量(LD50)為4.55×104cfu/g,說明該菌對鰻鱺的感染力已逐漸增強(qiáng),且其宿主的種類也已增加。

表3 菌株ET81126的主要生化指標(biāo)Tab.3 Main biochemical characteristics of strain ET81126

圖1 菌株ET81126的PCR擴(kuò)增圖譜Fig.1 PCR finger print of strain ET81126

對于病原菌的鑒定,以傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測方法中的生化特性鑒定最為常見。但由于生化特性鑒定操作繁瑣、耗時(shí)長且至今缺乏水產(chǎn)動(dòng)物病原細(xì)菌專用的鑒定系統(tǒng),包括培養(yǎng)溫度、孵育時(shí)間、生化指標(biāo)數(shù)據(jù)庫等。因此,對水產(chǎn)動(dòng)物病原細(xì)菌的生化鑒定仍然是借鑒動(dòng)物源細(xì)菌的鑒定方法。本試驗(yàn)采用快速診斷魚類細(xì)菌性疾病的API 20E生化系統(tǒng)進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示菌株ET81126利用甘露醇和阿拉伯糖,產(chǎn)生 H2S,與陳翠珍[10]報(bào)道的結(jié)果不一致,無法將其歸為遲鈍愛德華氏菌野生菌型或生物群1。其原因可能是API 20E系統(tǒng)設(shè)計(jì)的初衷是快速鑒別動(dòng)物腸道革蘭氏陰性菌,且檢測的生化指標(biāo)數(shù)量有限,造成對水產(chǎn)動(dòng)物病原細(xì)菌的鑒定存在一定的誤差[11]。因此,目前生化特性指標(biāo)的鑒定結(jié)果多作為分子生物學(xué)或免疫學(xué)等其它鑒定方法的佐證。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,16S rDNA測序是目前細(xì)菌分類和鑒定的一個(gè)有力工具,已廣泛用于多種魚類遲鈍愛德華氏菌的檢測,如日本鰻[6]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[12]、牙鲆(Para lichthysolivaceus)[13]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[14]、地圖魚(Astronotusocellatus)[15]、斑點(diǎn)叉尾鮰(Icta lurus punctatus)[16]、羅非魚(Tilapia nilotica)[17]。本試驗(yàn)對歐洲鰻病原菌進(jìn)行16S rDNA測序,表明分離菌與遲鈍愛德華氏菌自然聚為一支,可確定分離菌為遲鈍愛德華氏菌。因此,16S rDNA鑒定可為歐洲鰻遲鈍愛德華氏菌感染提供早期、快速、敏感、準(zhǔn)確的檢測。但是細(xì)菌的16S rDNA序列高度同源,只有少量堿基差異,通過NCBIBLASTN分析得到大量的同源序列,造成結(jié)果分析過程冗長復(fù)雜。因此,借助細(xì)菌種屬特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增愛德華氏菌屬的鞭毛基因簇,可以快速鑒別愛德華氏菌屬、種及其分型。本研究通過特異性PCR鑒定,進(jìn)一步確定菌株ET81126為遲鈍愛德華氏菌非典型菌株(E.tarda Atypical)。至于遲鈍愛德華氏菌的PCR分型方法(Typical、A typical)與傳統(tǒng)的分型方法(野生菌群、生物群1)之間的關(guān)系目前尚不明了,有待于進(jìn)一步的研究探討。

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