增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因與輪狀病毒VP6基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

潘小霞，張順，袁靜，文喻玲，陳元鼎

輪狀病毒（rotavirus，RV）屬于呼腸病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬，是引起嬰幼兒急性胃腸炎的主要病原體，每年死于 RV 感染者多達(dá) 61 萬余人[1]。RV 由三層蛋白組成：核心衣殼由各含12 個分子的 VP1 蛋白（轉(zhuǎn)錄酶）和 VP3 蛋白（鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶）及 120 個分子的 VP2 蛋白組成[2]；中間層衣殼由 780 個分子的 VP6 蛋白組成，VP6是病毒的組（亞組）抗原蛋白；外層衣殼由兩個具有中和抗原性的 VP4 和 VP7 蛋白組成，各含有180 個和 780 個分子。根據(jù) VP6 蛋白抗原性差異，可將 RV 分為 A ～ G 等 7 個組，其中 A 組RV 是嬰幼兒急性胃腸炎的主要病原體。根據(jù)編碼框（open reading frame，ORF）核苷酸序列同源性差異，至少可以將 A 組 RV 的 VP6 分為 14 個不同的基因型[3]。雖然 VP6 蛋白不是病毒轉(zhuǎn)錄酶，但 VP6 蛋白的存在對病毒的轉(zhuǎn)錄必不可少。此外，VP6 蛋白在維持病毒形態(tài)、病毒進(jìn)入細(xì)胞和組裝過程中起物理受體的作用。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，外殼蛋白的缺失和形成表層為 VP6 蛋白的兩層病毒顆粒（double-layered particle，DLP）是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA 所必需的[4-5]。大量實驗證明，VP4 和 VP7蛋白并非是免疫保護(hù)反應(yīng)的唯一抗原，RV 中殼蛋白 VP6 也能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。但這些試驗都是在小鼠模型中完成的，如果能證實 VP6在人體內(nèi)也具有安全有效的保護(hù)作用，那么研究并發(fā)展以 VP6 為基礎(chǔ)的疫苗會具有很好的應(yīng)用前景[6]。

綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）是較好的活體分子標(biāo)志物，易與目的基因形成融合蛋白且不影響自身目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。對多數(shù)宿主的生理無影響，不需依賴任何輔助因子或其他基質(zhì)就能在紫外線下激發(fā)出性質(zhì)穩(wěn)定易檢測的熒光。通過改造獲得的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）是 GFP 的一個突變體，熒光強(qiáng)度更高，光漂白抗性更強(qiáng)。

本實驗通過構(gòu)建 RV VP6 蛋白基因與 EGFP蛋白基因融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染到恒河猴腎傳代細(xì)胞 MA104 細(xì)胞中，EGFP 與目的基因 VP6 融合標(biāo)記為綠色，在熒光顯微鏡下觀察 VP6 基因的蛋白表達(dá)水平及其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況和表達(dá)量的變化，為探討 VP6 基因在結(jié)構(gòu)功能及免疫保護(hù)作用方面奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株、病毒和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒載體 pBS（pBluescript K/S）、恒河猴腎傳代細(xì)胞 MA104（用含 10% 的新生牛血清MEM 營養(yǎng)液培養(yǎng)）由本實驗保存；真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1 購自日本 Clontech 公司；TB-Chen 株病毒由本實驗室自 2 歲齡急性胃腸炎患者的大便樣品中分離得到，由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶和生化試劑 LA Taq DNA 聚合酶、DNA 限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶均購自日本 TaKaRa 公司；脂質(zhì)體 Lipofectamine? 2000購自美國 Invitrogen 公司；MEM 培養(yǎng)基購自美國Sigma 公司；引物合成及序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.1.3 主要儀器 Biofuge 15R 型低溫冷凍離心機(jī)購自德國 Heraeus 公司；Nikon E600 型熒光顯微鏡、DXM1200 型數(shù)字照相機(jī)購自日本尼康公司；ImageMasterR VDS 型數(shù)字成像儀購自美國Pharmacia Biotech 公司。

1.2 方法

1.2.1 融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1 引物設(shè)計 試驗所用 TB-Chen 株病毒為 A 組 RV，其基因型為 G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2/h2[7-9]。VP6 基因克隆自基因組中編碼 VP6 的第 6 基因，該基因全長為 1356 bp，編碼 397 個氨基酸，蛋白分子量約為 45 kD?；蛉L核苷酸及編碼氨基酸序列見 GenBank（Accession number：AY787645）。VP6 基因經(jīng)基因重組克隆到質(zhì)粒 pBS 上。根據(jù) VP6 基因核苷酸序列設(shè)計并合成引物。上游引物為 5’ ATC CGCGGAGCTCCACCGCGGTGGC 3’，下游引物為5’ GTGGATCCTATTACGGGCCCGTACCGTCG 3’。上游引物和下游引物中分別引入限制性核苷酸內(nèi)切酶位點 Sac （IGAGCTC）和 BamH （IGGATCC）。

1.2.1.2 TB-Chen VP6 基因的擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)混合液體積為 100 μl，含有 30 ng 模板 DNA（攜帶 VP6 全基因的 pBS-VP6 質(zhì)粒 DNA），60 pmol/L dNTPs，10 μl 10 × PCR 緩沖液，5 U Taq DNA 聚合酶，60 pmol/L 上游引物，60 pmol/L 下游引物。反應(yīng)條件為 94 ℃ 預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性 40 s，56 ℃ 復(fù)性 40 s，72 ℃ 延伸 1 min，擴(kuò)增 40 個循環(huán)；最后，72 ℃ 反應(yīng) 10 min。取 5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在 1.5% 的瓊脂糖凝膠（含 0.5 μg/ml 溴乙錠）中電泳檢測，回收目的擴(kuò)增片段。

1.2.1.3 融合基因的連接和表達(dá)質(zhì)粒的篩選 PCR 擴(kuò)增的 VP6 基因片段及載體 pEGFP-C1質(zhì)粒 DNA 分別用 Sac I 和 BamH I 雙酶切后，目的基因片段和質(zhì)粒載體片段在 T4 DNA 連接酶的作用下連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含卡那霉素（30 mg/L）的 LB 平板培養(yǎng)。挑取單個菌落進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增、堿裂解法制備重組質(zhì)粒和酶切鑒定。重組質(zhì)粒最后經(jīng)核苷酸序列測定確定。

1.2.2 融合蛋白在 MA104 細(xì)胞中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染前一天，將 MA104 細(xì)胞接種到 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（5 × 104個/孔，內(nèi)裝有蓋玻片）。轉(zhuǎn)染時，蓋玻片上的 MA104 細(xì)胞單層用不含抗生素的 PBS 洗液洗 3 次，加入不含抗生素和新生牛血清的 MEM生長培養(yǎng)基，每孔 800 μl；將 1.6 μg 質(zhì)粒 DNA 稀釋在 100 μl 不含抗生素和小牛血清的生長培養(yǎng)基中，輕輕混勻；將 4 μl 的脂質(zhì)體 Lipofectamine?2000 稀釋在 100 μl 的不含抗生素和新生牛血清的生長培養(yǎng)基中，輕輕混勻后在室溫下孵育 5 min；將稀釋的質(zhì)粒 DNA 和脂質(zhì)體 Lipofectamine?2000 混合，總體積為 200 μl，輕輕混勻，室溫孵育 20 min，形成脂質(zhì)體復(fù)合物。將脂質(zhì)體復(fù)合物加到含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，每孔 200 μl，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板，混勻，于 37 ℃， 5% CO2培養(yǎng)箱孵育 4 ～ 6 h 后，吸出吸附液，加入 1 ml 含抗生素和 10% 小牛血清的 MEM 培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后不同時間，在熒光顯微鏡下檢測融合蛋白的表達(dá)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 VP6 基因編碼序列的 PCR 擴(kuò)增

以攜帶 VP6 全基因的質(zhì)粒 pBS-VP6 為模板擴(kuò)增 VP6 基因后，在 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳中檢測，在預(yù)期位置（1116 bp）檢測到一擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，大小正確（圖 1）。

圖 1 VP6 基因的 PCR 擴(kuò)增Figure 1 PCR of VP6 gene

2.2 融合表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-VP6 的構(gòu)建

VP6 的 PCR 回收產(chǎn)物及載體 pEGFP-C1 質(zhì)粒 DNA 經(jīng)過 Sac I 和 BamH I 雙酶切后，在 T4 DNA 連接酶的作用下連接，然后轉(zhuǎn)化到 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)堿裂解法提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進(jìn)行 Sac I/BamH I 酶切鑒定（圖 2）。酶切鑒定后的pEGFP-VP6 進(jìn)行雙向核苷酸序列測定。結(jié)果表明，插入表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-C1 上的 VP6 編碼基因序列完整，方向正確，融合表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-VP6 構(gòu)建成功。

圖 2 重組質(zhì)粒 pEGFP-VP6 的酶切鑒定Figure 2 Identification of expression plasmid pEGFP-VP6

2.3 融合蛋白 EGFP-VP6 在 MA104 細(xì)胞中不同時間的表達(dá)

融合表達(dá)載體 pEGFP-VP6 及綠色熒光蛋白載體 pEGFP-C1 轉(zhuǎn)染 MA104 細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察，并以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做空白對照。結(jié)果顯示，融合蛋白 EGFP-VP6 分布于細(xì)胞質(zhì)中，呈較均勻的分布狀態(tài)（圖 3B），與 RV 感染細(xì)胞中合成的 VP6 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中形成毒質(zhì)體（viroplasma）樣結(jié)構(gòu)有較大的差別[10]。細(xì)胞核中沒有觀察到融合蛋白。綠色熒光蛋白載體pEGFP-C1 的轉(zhuǎn)染效率較高，熒光蛋白均勻分布于整個 MA104 細(xì)胞中（包括細(xì)胞核）（圖 3C）。在轉(zhuǎn)染 3 h 后，即可觀察到細(xì)胞發(fā)出熒光，隨著時間的延長，發(fā)出熒光的細(xì)胞不斷增多，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，圍繞細(xì)胞核向周圍彌散擴(kuò)散，在轉(zhuǎn)染 21 h 后，蛋白表達(dá)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染 27 ～ 39 h 之間，熒光最多。72 h后，熒光淬滅，細(xì)胞形態(tài)消失（圖 4）。未轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞沒有檢測到熒光。

3 討論

VP6 作為 RV 的組和亞組抗原蛋白在病毒株的分類鑒定上具有重要意義[11]，作為疏水性蛋白的VP6 蛋白也具有較強(qiáng)的抗原反應(yīng)性和免疫原性[12]。另外，在小鼠模型中用 VP6 蛋白或 VP6 蛋白編碼 DNA 免疫能產(chǎn)生體內(nèi)保護(hù)[4,12-14]。有佐劑的條件下，無論是口服、鼻腔免疫還是腸道免疫，VP6 蛋白疫苗都能有效降低或防止 RV 排出。同時 VP6蛋白也具有 CD4+T 細(xì)胞表位和交叉反應(yīng)的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位，以 VP6 蛋白作為疫苗抗原或疫苗基質(zhì)可能會有較好的應(yīng)用前景。

研究表明，在有佐劑 LT（R192G）條件下，使用麥芽糖結(jié)合 VP6 蛋白（MBP::VP6）鼻腔免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的免疫小鼠都能免受 RV EDIM 株的攻擊，排毒水平降低 ＞ 98%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于MBP::VP4 或 MBP::VP7 的保護(hù)作用[15]。Feng等[4]研究發(fā)現(xiàn)，VP6 蛋白特異性 IgA 單克隆抗體，如 7D9 可以使 SCID 小鼠免受 RV 感染，并能清除 RV 慢性感染。認(rèn)為 VP6 蛋白的特異性單克隆抗體通過與 VP6 蛋白結(jié)合后引起 VP6 蛋白三聚體構(gòu)象發(fā)生變化，處于核心的病毒 RNA 聚合酶活性降低，從而使病毒顆粒失去了轉(zhuǎn)錄活性，在病毒復(fù)制循環(huán)過程的一開始就阻止了病毒在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄復(fù)制。

在小鼠體內(nèi)，眾多的實驗表明，經(jīng) RV 的 VP6蛋白免疫動物后在動物體內(nèi)確實能引起抗 RV 感染的作用，但目前對 VP6 蛋白的免疫保護(hù)機(jī)制還不是很清楚。VP6 蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的 IgA 在跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運中可能和小腸上皮細(xì)胞中缺失外殼蛋白的 RV 顆粒相互作用進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)中和病毒[4]，也可能是 VP6 抗體和 VP6 蛋白結(jié)合后阻斷了 VP6蛋白與細(xì)胞上受體的相互作用，或誘導(dǎo)病毒顆粒發(fā)生構(gòu)象變化，使病毒不能吸附到宿主細(xì)胞上。對于抗 VP6 抗體的具體保護(hù)機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

圖 3 重組質(zhì)粒 pEGFP-VP6 在 MA104 細(xì)胞中的表達(dá)（A：未轉(zhuǎn)染的 MA104 細(xì)胞對照；B：融合表達(dá)載體 pEGFP-VP6 轉(zhuǎn)染 MA104 細(xì)胞；C：綠色熒光蛋白載體質(zhì)粒 pEGFP-C1 轉(zhuǎn)染 MA104 細(xì)胞）Figure 3 The expression of recombinant plasmid pEGFP-VP6 in MA104 cells (A: The no-transfected cells; B: The cells transfected with plasmids pEGFP-VP6; C: The cells transfected with plasmids pEGFP-C1)

圖 4 融合蛋白 EGFP-VP6 在 MA104 細(xì)胞中不同時間的表達(dá)情況（A：3 h；B：9 h；C：15 h；D：21 h；E：27 h；F：33 h；G：39 h；H：72 h）Figure 4 Analysis of fusion protein EGFP-VP6 expression in MA104 cells at 3 h (A), 9 h (B), 15 h (C), 21 h (D), 27 h (E), 33 h (F),39 h (G), 72 h (H) transfection with plasmid pEGFP-VP6

pEGFP-C1 是一個能表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的質(zhì)粒，由人工合成和優(yōu)化且適于哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)，主要用于判定轉(zhuǎn)基因的效率和目的基因定位，以及目的基因表達(dá)與功能關(guān)系的研究。在本實驗中，我們以攜帶 VP6 全基因的質(zhì)粒 pBS-VP6 為模板擴(kuò)增 VP6 基因，將擴(kuò)增片段雙酶切后連接到質(zhì)粒 pEGFP-C1 中，構(gòu)建重組表達(dá)載體 pEGFP-VP6，并用脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染到恒河猴腎細(xì)胞 MA104中。在轉(zhuǎn)染 3 h 后，即可觀察到細(xì)胞發(fā)出熒光，蛋白分布在胞質(zhì)中，但并沒有像 RV 感染細(xì)胞中合成的 VP6 蛋白可在細(xì)胞質(zhì)中形成毒質(zhì)體樣結(jié)構(gòu)[10]。該結(jié)果提示，由于沒有其他 RV 成分的相互作用，與 EGFP 融合表達(dá)的 VP6 蛋白沒有處于參與轉(zhuǎn)錄或組裝過程中物理受體的狀態(tài)。本研究通過綠色熒光蛋白的示蹤技術(shù)，證實了 VP6 基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)及分布狀況，并為進(jìn)一步研究 VP6 基因的功能及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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