減毒流感病毒A/California/07/2009ca疫苗候選株在雪貂上的保護(hù)性研究

段躍強(qiáng) 李曉楠 曹 東 魏 澍 楊鵬輝 邢 麗 王希良 李培鋒

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特010018)

甲型流感病毒是一類可導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率的傳染性病毒，甲型 H1N1(A/California/07/2009)流感病毒是爆發(fā)于墨西哥和美國(guó)的流感大流行的病原體，自爆發(fā)后蔓延全球，引起世界的恐慌［1-3］。截至2010年底，全球已有213個(gè)國(guó)家報(bào)道確診病例17 410例。

流感病毒在雪貂間的傳播與人類傳播最為相似，因此，目前雪貂被認(rèn)為是檢測(cè)流感病毒最理想的動(dòng)物模型［4-6］。通常情況下，研究人員選擇具有代表性的H1N1流感病毒在雪貂間進(jìn)行傳播試驗(yàn)，以評(píng)估這些病毒經(jīng)飛沫傳播的可能性，同時(shí)也通過接種病毒，來觀察雪貂的發(fā)病情況［7-9］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用減毒A/California/07/2009ca病毒及BJ501病毒免疫雪貂，通過對(duì)雪貂的各生理指標(biāo)、各器官的病毒載量的檢測(cè)，來評(píng)價(jià)減毒A/California/07/2009ca病毒的弱毒性及免疫保護(hù)性。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、雞胚、毒株及動(dòng)物 MDCK細(xì)胞，購自ATCC公司;減毒A/California/07/2009ca流感病毒本室拯救;野毒株BJ501由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供;雪貂購自江蘇無錫。

1.2主要試劑 DMEM、TPCK胰酶購自Sigma;胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自CORNING公司。

1.3TCID50的測(cè)定 用MDCK細(xì)胞鋪96孔板，每孔4×104個(gè)細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后，病毒按101、102、103……倍數(shù)稀釋。每孔200 μl，稀釋液為MEM 無血清培養(yǎng)基(含TPCK胰酶1 μg/ml)，5天后電鏡下觀察結(jié)果，用Reed-Muench法計(jì)算TCID50，TCID50=高于50%感染病毒稀釋度的對(duì)數(shù)+(高于50%感染百分?jǐn)?shù)-50)/(高于50%感染百分?jǐn)?shù)-低于50%感染百分?jǐn)?shù))。

1.4A/California/07/2009ca、BJ501病毒的毒力研究 10～12周雌性雪貂每組3只，共2組，分別滴鼻免疫A/California/07/2009ca、BJ501病毒，每只免疫107TCID50/200 μl，連續(xù)14天觀察雪貂的死亡率、體重、精神狀態(tài)，并在1、2、3、4、5、7 天時(shí)應(yīng)用咽拭子取鼻腔病毒［應(yīng)用無血清 MEM(50 μg/ml慶大霉素)洗脫］，過濾;應(yīng)用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板檢測(cè)鼻腔中病毒的TCID50。

1.5A/California/07/2009ca的各器官病毒載量的研究 10～12周雌性雪貂3只，滴鼻免疫A/California/07/2009ca，每只免疫 107TCID50/200 μl，免疫 3天后取雪貂鼻、肺、脾、腦、腎等器官研磨勻漿后，離心收集病毒，應(yīng)用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板檢測(cè)各個(gè)器官中的病毒TCID50。

1.6A/California/07/2009ca免疫保護(hù)性研究10～12周雌性雪貂每組3只，共2組，實(shí)驗(yàn)組1、21天滴鼻免疫 107TCID50/200 μl A/California/07/2009ca病毒，21、35天采血。實(shí)驗(yàn)組免疫35天后和空白對(duì)照組都給予107TCID50/200 μl BJ501病毒，免疫3天后取雪貂鼻、肺、脾、腦、腎等器官研磨勻漿后，離心收集病毒，應(yīng)用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板檢測(cè)各個(gè)器官中的病毒TCID50。HI抗體的滴度利用4單位病毒在U型96孔血凝板上用0.5%雞紅細(xì)胞檢測(cè)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。以t檢驗(yàn)及線性回歸分析檢查不同組間差異性及其相關(guān)性，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著界限。

2 結(jié)果

2.1病毒的TCID50檢測(cè) MDCK細(xì)胞鋪96孔板，每孔2×104～4×104個(gè)細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后，A/California/07/2009ca、BJ501 病 毒 按 101、102、103……稀釋;每孔 200 μl，MEM 無血清培養(yǎng)基稀釋，同時(shí)以TPCK胰酶(1 μg/ml)為對(duì)照組，5天后觀察結(jié)果見表1，BJ501加胰酶前后基本沒有變化，而A/California/07/2009ca變化較大，加胰酶較不加胰酶高1.25 TCID50。

2.2滴鼻免疫A/California/07/2009ca、BJ501病毒后雪貂的生理指標(biāo)檢測(cè) A/California/07/2009ca、BJ501病毒免疫雪貂后，由表2～4可知，A/California/07/2009ca病毒免疫后雪貂精神狀態(tài)正常，沒有死亡，體重有輕微下降后又迅速恢復(fù)。而BJ501卻在3天時(shí)出現(xiàn)了感冒癥狀，沒有死亡，體重有小幅度的下降。

2.3滴鼻免疫A/California/07/2009ca、BJ501病毒后雪貂鼻腔病毒載量的檢測(cè) A/California/07/2009ca、BJ501病毒免疫雪貂后，由表5可見，A/California/07/2009ca病毒在鼻腔內(nèi)有較低的復(fù)制，4天后檢測(cè)不到病毒;BJ501病毒7天內(nèi)都保持較高的病毒滴度。

表1 H1N1病毒的TCID50檢測(cè)Tab．1 Detection of TCID50of H1N1 virus

表2 H1N1病毒免疫雪貂后精神狀態(tài)的變化Tab.2 Mental status changes of ferrets immunized with H1N1 virus

表3 H1N1病毒免疫雪貂后死亡率的變化Tab.3 Mortality changes of ferrets immunized with H1N1 virus

表4 H1N1病毒免疫雪貂后體重的變化Tab.4 Body weight changes of ferrets immunized with H1N1 virus

表5 H1N1病毒免疫雪貂后在不同時(shí)間段鼻腔病毒載量的變化Tab.5 The nasal viral load changes of ferrets at different time points immunized with H1N1 virus

表6 A/California/07/2009ca病毒免疫雪貂后不同器官的病毒載量Tab.6 The viral load in different organs of ferrets immunized with A/California/07/2009ca virus

圖1 免疫后雪貂血清的HI實(shí)驗(yàn)Fig．1 HI test of serum of immunized ferret

2.4A/California/07/2009ca病毒免疫雪貂后各器官病毒載量的檢測(cè) A/California/07/2009ca病毒滴鼻免疫雪貂3天后，處死雪貂，由表6可見，A/California/07/2009ca病毒在鼻、肺有少量復(fù)制，脾、腎、腦中沒有檢測(cè)到病毒。

2.5A/California/07/2009ca病毒在雪貂上的免疫保護(hù)性

2.5.1HI實(shí)驗(yàn) A/California/07/2009ca病毒滴鼻免疫雪貂，采集血清樣本，分別對(duì)A/California/07/2009ca病毒及BJ501病毒做HI檢測(cè)，由圖1可見，抗體對(duì) A/California/07/2009ca病毒及BJ501病毒都具有很好的中和效果，并且兩病毒HI結(jié)果之間無差異(P＞0.05)。

2.5.2BJ501病毒免疫雪貂后各器官病毒載量的檢測(cè) A/California/07/2009ca病毒二免14天的雪貂和空白對(duì)照組的雪貂滴鼻免疫BJ501病毒，3天后處死雪貂;由表7可見空白對(duì)照組的雪貂在鼻、肺中檢測(cè)到較高的病毒復(fù)制，TCID50分別達(dá)到了6.9和4.6，并且腦中也檢測(cè)到1.3TCID50的病毒，腎、脾中沒有檢測(cè)到病毒。A/California/07/2009ca病毒組的雪貂在鼻、肺中檢測(cè)到少量BJ501病毒復(fù)制，脾、腎、腦中沒有檢測(cè)到病毒。

表7 BJ501病毒免疫雪貂后各器官病毒載量Tab.7 The viral load in different organs of ferrets immunized with BJ501 virus

3 討論

流感病毒具高傳染性，每年在很多國(guó)家都會(huì)造成區(qū)域性的流行，20世紀(jì)曾發(fā)生過4～5次世界大流行，每次間隔9～39年。其中以1918～1919年期間H1N1流感病毒造成4 500萬人的死亡最為嚴(yán)重。從數(shù)次大流行情況來看，H1N1爆發(fā)次數(shù)最多［10，11］。

自1998年應(yīng)用流感病毒基因片段構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到流感病毒用以研制疫苗以來，直到現(xiàn)在這種方法得到的病毒株都是流感疫苗株的主要來源。減毒流感疫苗2002年首次出現(xiàn)報(bào)道，并在以后的發(fā)展中因其諸多優(yōu)點(diǎn)越來越引起人們的重視，減毒流感疫苗具有抗原用量小的特點(diǎn)，且效果很好。適用于5～17歲健康少年兒童以及18～49歲健康成人［12］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用減毒A/California/07/2009ca流感病毒以BJ501病毒為對(duì)照，由表1可見，A/California/07/2009ca病毒在加入TPCK胰酶后，TCID50升高1.25倍，而BJ501病毒沒有變化，這說明A/California/07/2009ca病毒對(duì)TPCK胰酶敏感，TPCK胰酶能夠提高對(duì)A/California/07/2009ca病毒的檢測(cè)靈敏度。

A/California/07/2009ca流感病毒滴鼻免疫雪貂后，對(duì)雪貂的精神狀態(tài)(表2)、死亡率(表3)、體重(表4)等生理指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。A/California/07/2009ca流感病毒組沒有出現(xiàn)異常生理反應(yīng)，而BJ501病毒免疫后，雪貂出現(xiàn)感冒癥狀，這說明A/California/07/2009ca流感病毒毒力不足以引起雪貂機(jī)體的生理變化，同時(shí)可見A/California/07/2009ca流感病毒呈現(xiàn)弱毒的特征，而BJ501病毒呈現(xiàn)強(qiáng)毒的特征。

在此基礎(chǔ)上我們對(duì)病毒在雪貂鼻腔中的復(fù)制情況進(jìn)行檢測(cè)，減毒A/California/07/2009ca流感病毒(表5)在雪貂鼻腔中4天后即檢測(cè)不到，而BJ501病毒在免疫1～7天都保持著較高的病毒滴度;從各器官病毒載量來看減毒A/California/07/2009ca流感病毒(表6)在鼻、肺中有低量復(fù)制，在脾、腎、腦中沒有病毒復(fù)制。BJ501病毒(表7)除在鼻、肺中有較高復(fù)制外，在腦中也有復(fù)制。這說明減毒A/California/07/2009ca流感病毒是弱毒的，而BJ501病毒具有較強(qiáng)的毒力。

A/California/07/2009ca流感病毒免疫雪貂后，從HI實(shí)驗(yàn)(圖1)結(jié)果來看，A/California/07/2009ca病毒的抗體對(duì)BJ501病毒具有較好的中和效果，與A/California/07/2009ca病毒無差異;二免兩周后，BJ501病毒免疫雪貂，通過對(duì)不同器官BJ501病毒的檢測(cè)(表7)我們可以看到，和空白對(duì)照組相比，雪貂鼻、肺的病毒載量都顯著降低，腦中沒有檢測(cè)到病毒。這說明減毒A/California/07/2009ca流感病毒產(chǎn)生的抗體是有效的，對(duì)雪貂具有一定的免疫保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用減毒A/California/07/2009ca流感病毒及BJ501病毒免疫雪貂，通過對(duì)雪貂機(jī)體各項(xiàng)生理指標(biāo)的檢測(cè)及不同時(shí)間點(diǎn)鼻腔的病毒載量、各個(gè)器官的病毒載量、攻毒后的各個(gè)器官病毒載量的檢測(cè)，證明減毒A/California/07/2009ca流感病毒具有減毒性、不致病性及一定的免疫保護(hù)性。這些數(shù)據(jù)的獲得為今后減毒疫苗株的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。

1 杜 寧，王大燕，舒躍龍et al.2009新甲型H1N1流感病毒病原學(xué)概述［J］. 病毒學(xué)報(bào)，2009;25(6)：479-483.

2 Centers for Disease Control and Prevention(CDC).Swine influenza A(H1N1)infection in two children-Southern California，March-A-pril 2009［J］.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009;58(15)：400-402.

3 史芳芳，李紅葉，劉玉霞et al.多重RT-PCR方法檢測(cè)甲型流感病毒［J］.免疫學(xué)雜志，2011;27(2)：162-165.

4 Dybing J K，Stacey S C，Swayne D E et al.Distinct pathogenesis of Hong Kong-origin H5N1 viruses in mice compared to that of other highly pathogenic H5 avian influenza viruses［J］.J Virol，2000;74(3)：1443-1450.

5 Banks J，Speidel E C，McCauley J W et al.Phylogenetic analysis of H7 haemagglutinin subtype influenza A viruses ［J］.Arch Virol，2000;145(5)：1047-1058.

6 楊松濤，高玉偉，夏咸柱et al.虎源H5N1亞型禽流感病毒感染小鼠模型的建立［J］.中國(guó)病毒學(xué)，2006;21(4)：253-357.

7 Munster V J，de Wit E，van den Brand J M et al.Pathogenesis and Transmission of Swine-Origin 2009 A(H1N1)Influenza Virus in Ferrets［J］.Science，2009;325(5939)1126-1177.

8 Maines T R，Jayaraman A，Belser J A et al.Transmission and Pathogenesis of Swine-Origin 2009 A(H1N1)Influenza Viruses in Ferrets and Mice［J］.Science，2009;325(5939)：484-487.

9 Forrest H L，Khalenkov A M，Govorkova E A et al.Single-and multiple-clade influenza A H5N1 vaccines induce cross protection in ferrets［J］.Vaccine，2009;(27)：4187-4195.

10 鮑琳琳，占玲俊，秦 川et al.雪貂感染流感病毒H3N2動(dòng)物模型的建立［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2011;21(8)：5-9.

11 Amorsolo L，Suguitan Jr，Josephine M et al.Live，attenuated influenza A H5N1 candidate vaccines provide broad cross-protection in mice and ferrets［J］.Plos Medicine，2006;360(9)：154-169.

12 Yang P H，Duan Y Q，Wang C H et al.Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated vaccine against the 2009 pandemic A H1N1 in mice and ferrets［J］.Vaccine，2011;29(4)：698-705.