柱前在線衍生-HPLC內(nèi)標法快速測定腦蛋白水解物注射液中的氨基酸

馮 輝 董祥君 吳 焱 孫海俠

(1.長春市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院,長春 130012； 2.山東科興生物制品有限公司，濟南 250200)

腦蛋白水解物注射液(cerebroprotein hydrolysate injection)是以健康豬腦(或牛腦)經(jīng)酶水解制成的無菌制劑，主要成分是游離氨基酸和小分子多肽[1]。據(jù)藥理和臨床試驗表明：腦蛋白水解物注射液能調(diào)節(jié)和改善神經(jīng)元的代謝，促進突觸的形成，誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化，保護神經(jīng)細胞免受各種缺血和神經(jīng)毒素的損害。該制劑臨床用于治療顱腦外傷，腦血管病后遺癥伴有記憶力減退及注意力集中障礙等癥狀[2]。腦蛋白水解物注射液中各種氨基酸含量是評價其質(zhì)量標準的一項重要指標。目前報道的用HPLC測定腦蛋白水解物注射液中氨基酸含量的方法很多[1-7]，這些方法普遍使用外標法定量且分析時間至少需要30 min。雖然外標法是色譜分析常用的定量方法之一，但是當樣品的前處理比較復(fù)雜,尤其是使用柱前衍生時，由于每個樣品衍生效率可能有所不同，往往會造成較大的測定誤差。較長的分析時間會造成試劑和時間等的浪費，增加檢測成本。

筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，在樣品處理前加入內(nèi)標，校正物理和化學(xué)損失，從而提高了分析的準確性和可靠性。使用反相C18短柱二元高壓梯度洗脫分析時間僅需14 min，比傳統(tǒng)氨基酸分析方法節(jié)省時間1倍以上，大大提高了檢測效率。采用OPA和FMOC-Cl聯(lián)合柱前在線衍生，節(jié)省了大量人力和時間，同時又提高了分析結(jié)果的重復(fù)性。使用DAD和FLD聯(lián)合檢測，既保證一級和二級氨基酸全部測定，又比單獨使用紫外檢測器的靈敏度提高10倍以上[8]。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1100型，配G1322A真空脫氣機、G1312A雙元泵、G1329A自動進樣器、G1330A自動進樣器控溫裝置、G1316A柱溫箱、G1315B二極管陣列檢測器、G1321A熒光檢測器和A08.03化學(xué)工作站，美國Agilent公司；

真空泵：DOA-V130-BN型，美國Waters公司；

臺式離心機：EBA21型，德國Hettich公司；

快速混勻器：Inchi HM-10型，日本Jircas公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

三氯乙酸、NaH2PO4·H2O：優(yōu)級純，美國Sigma-Aldrich公司；

色氨酸、內(nèi)標戊氨酸、硼酸緩沖液、OPA和FMOC：色譜純，美國Agilent公司；

17種氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸)標準混合液及固體粉末標準品：色譜純，瑞士Fluka公司；

鹽酸：優(yōu)級純，北京化學(xué)試劑廠；

NaOH：分析純，北京化學(xué)試劑廠；

實驗用水為雙蒸水；

腦蛋白水解物注射液樣品：吉林華康藥業(yè)股份有限公司。

1.2 色譜條件

(1)色譜柱：Zorbax Eclipse AAA C18柱(75 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相A：稱取NaH2PO4·H2O5.52 g溶于1 000 mL水中，用10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.8，過0.45 μm膜；流動相B：乙腈-甲醇-水(體積比45∶45∶10)；流速：2 mL/min；柱溫：40℃；DAD檢測波長：紫外波長338 nm(譜帶寬10 nm)，參考波長390 nm(譜帶寬20 nm)；FLD檢測波長：0.0～8.5 min內(nèi)，激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm，8.5～14.0 min內(nèi)，激發(fā)波長266 nm，發(fā)射波長305 nm。

(2)流動相梯度洗脫程序

0.0～1.0 min，B：0%；1.0～9.8 min，B：0%～57%；9.8～10.0 min，B：57%～100%；10.0～12.0 min，B：100%；12.0～12.5 min，B：100%～0%；12.5～14.0 min，B：0%。

(3)自動衍生程序

分別吸取 2.5 μL硼酸緩沖液和 0.5 μL標準溶液或樣品測定液，充分混合，靜置30 s；洗針；吸取 0.5 μL OPA充分混合；洗針；吸取0.5 μL FMOC充分混合；吸取32 μL水，充分混合；進樣量為18 μL。

1.3 試液配制

(1)氨基酸混合標準液的配制：準確稱取適量色氨酸和戊氨酸，用0.1 mol/L HCl分別配制成濃度為18 mmol/L和50 mmol/L的儲存液，臨用時稀釋。將濃度為1 mmol/L的17種氨基酸混合標準液稀釋至不同濃度，再與適當濃度的色氨酸和戊氨酸溶液按一定比例混合，配制成濃度分別為4.5、45、225、450、900 μmol/L的19種氨基酸(戊氨酸的濃度均為250 μmol/L)系列混合標準溶液。

(2)提取液配制：準確稱取適量戊氨酸，用5%的三氯乙酸配制成濃度為2 551.02 μmol/L的溶液，臨用時稀釋為濃度為255.102 μmol/L的提取液。

1.4 樣品處理

準確量取腦蛋白水解物注射液樣品20 μL于1.5 mL離心管中，加入提取液充分混合(混合后內(nèi)標戊氨酸的濃度為250 μmol/L)。室溫靜置15 min后以14 000 r/min離心15 min，取上清液100 μL于HPLC樣品瓶中，按1.2中的自動衍生程序衍生后測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標物的選擇

由于每個腦蛋白水解物注射液樣品的前處理尤其是衍生效率往往很難一致，所以造成測定結(jié)果的誤差較大。如果使用內(nèi)標法，在樣品處理之前將已知濃度的Nova作為內(nèi)標物加到樣品中，使之與其它氨基酸在相同的樣品處理和衍生條件下進行測定，便可起到校正物理和化學(xué)損失的作用，達到提高測定的準確性和可靠性的目的。

內(nèi)標法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標物[9]。本研究選用Nova為內(nèi)標，首先它不存在于天然蛋白質(zhì)中，即不存在于腦蛋白水解物中，其性質(zhì)與其它氨基酸十分相近，且能完全溶解于被測樣品中；在色譜分離中Nova峰接近其它氨基酸峰，位于各峰之間，且與它們能完全分開。由此可見,Nova是使用內(nèi)標法測定腦蛋白水解物注射液中氨基酸含量時理想的內(nèi)標物。

2.2 提取溶劑和提取時間的選擇

腦蛋白水解物注射液成分較為復(fù)雜，尤其是肽類物質(zhì)對氨基酸的提取與測定有嚴重的影響,因此必須在提取游離氨基酸的同時將其除去。本試驗選用了甲醇、乙腈、三氯乙酸、高氯酸和磺基水楊酸等不同濃度的溶液作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn),5%的三氯乙酸提取效果最好，既保證色譜分離過程中無干擾，又可以使所有氨基酸全部溶解；另外，使用5%三氯乙酸為提取液，避免了甲醇、乙腈等試劑的揮發(fā)和高氯酸等試劑的強腐蝕性對人體造成的傷害。

使用5%的三氯乙酸為提取溶劑，將腦蛋白水解物注射液分別于室溫下提取5、10、15、20、25 min，結(jié)果表明，15 min以后游離氨基酸總量不再增加，所以提取的最佳時間為15 min。

2.3 衍生試劑的選擇

OPA和FMOC-Cl是氨基酸分析的柱前衍生試劑，兩者聯(lián)合使用有如下優(yōu)點：(1)OPA和FMOC-Cl與氨基酸衍生反應(yīng)時間都很短，只需30 s即可完成[10]，特別適合在線衍生；(2)衍生時OPA首先與一級氨基酸反應(yīng)，然后FMOC-Cl 再與未被衍生的二級氨基酸反應(yīng)，兩者起到互補的作用，大大提高了衍生效率；(3)衍生所產(chǎn)生的副產(chǎn)物在氨基酸之后被洗脫出來，不影響分離和定量。

2.4 檢測方式的選擇

本研究使用DAD和FLD聯(lián)合檢測氨基酸的衍生物。使用FLD檢測時干擾少，基線噪音小，檢測靈敏度比DAD高出幾個數(shù)量級[11]，但是 Lys的響應(yīng)值小，用 DAD來補充便可解決這一問題。如果在不具備FLD的情況下，單獨使用DAD在8.5 min處進行波長轉(zhuǎn)換(紫外波長262 nm，譜帶寬16 nm；參考波長324 nm，譜帶寬8 nm)也可以完成一級和二級氨基酸的檢測，但是存在受基質(zhì)干擾大、基線不穩(wěn)定和檢測靈敏度低的缺點。

2.5 色譜圖

圖1分別為氨基酸標準混合液和腦蛋白水解物注射液樣品色譜圖，其中a、c為DAD檢測信號，b、d為FLD檢測信號。

1—天冬氨酸; 2—谷氨酸; 3—天冬酰胺; 4—絲氨酸;5—谷氨酰胺; 6—組氨酸; 7—甘氨酸; 8—蘇氨酸; 9—精氨酸; 10—丙氨酸; 11—酪氨酸; 12—胱氨酸; 13—纈氨酸; 14—蛋氨酸; 15—戊氨酸; 16—色氨酸; 17—苯丙氨酸; 18—異亮氨酸; 19—亮氨酸; 20—賴氨酸; 21—脯氨酸圖1 氨基酸混合標準液(a、b)和腦蛋白水解物注射液樣品(c、d)色譜圖

由圖1可見，各種氨基酸經(jīng)衍生后，在1.2的色譜條件下得到了很好地分離，幾種比較難分離的氨基酸對甘氨酸/蘇氨酸、纈氨酸/甲硫氨酸和苯丙氨酸/異亮氨酸的分離度分別是1.60、1.56和1.33，均超過了準確測量所需最低分離度1.25。完成每個樣品分析僅需14 min，較傳統(tǒng)的氨基酸分析方法縮短分析時間1倍以上，大大提高了檢測效率。圖中3號峰和5號峰分別是天冬酰胺和谷氨酰胺，它們是天門冬氨酸和谷氨酸在腦蛋白水解過程中的前體。如果一個樣品中不含有這兩種氨基酸，則很可能不是腦蛋白的水解物，而是由直接添加人工氨基酸制得。所以樣品中是否含有天冬酰胺和谷氨酰胺可作為鑒別腦蛋白水解物注射液真?zhèn)蔚囊豁棙藴省?/p>

2.6 空白試驗

按1.2色譜條件分別測定空白的5%三氯乙酸提取液和帶內(nèi)標的5%三氯乙酸提取液，前者除衍生試劑所產(chǎn)生的色譜峰外未發(fā)現(xiàn)干擾峰，后者除內(nèi)標峰和衍生試劑峰外也未發(fā)現(xiàn)干擾峰。

2.7 衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性

將氨基酸衍生產(chǎn)物分別放置0、6、12、24 h后進行色譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各衍生產(chǎn)物在放置24 h后，峰面積有輕微的減少，但不十分明顯，說明衍生產(chǎn)物在24 h以內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 線性關(guān)系、檢出限和定量限

將1.3(1)中所配制的5種濃度的氨基酸混合標準液，按1.2的色譜條件進行測定，以各氨基酸峰面積Y為縱坐標，氨基酸濃度X(μmol/L)為橫坐標進行線性回歸，各氨基酸濃度在4.5～900 μmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r在0.998 7～0.999 9之間。以信噪比S/N=3計算檢出限(LOD)，以信噪比S/N=10計算定量限(LOQ)，結(jié)果見表1。由于賴氨酸是使用DAD檢測，所以LOD和LOQ明顯高于用FLD檢測的其它氨基酸。

表1 16種氨基酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.9 回收試驗

準確量取已測定出氨基酸含量的腦蛋白水解物注射液樣品9份,分成3組，每組3份，每組分別按氨基酸含量80%、100%和120%左右加入氨基酸的固體標準品，測定其回收率和相對標準偏差，結(jié)果列于表2。從表2可見，各氨基酸的回收率在95.39%～105.33%范圍內(nèi)，相對標準偏差為2.13%～5.26%(n=3)。說明該方法準確度和精密度高，方法可靠。

表2 16種氨基酸回收率(n=3)

2.10 精密度試驗

按1.2色譜條件測定腦蛋白水解物注射液，進行日間和日內(nèi)精密度試驗(n=7)，結(jié)果見表3。由表3可見，日內(nèi)相對標準偏差小于5%，日間相對標準偏差小于10%，符合藥物分析的要求。

表3 16種氨基酸的日內(nèi)和日間測定精密度(n=7)

2.11 實際樣品測定

分別采用內(nèi)標法和外標法對3個不同批次的腦蛋白水解物注射液樣品(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)進行氨基酸含量的測定，每個樣品測定5次，計算平均值，同時計算標準偏差和相對標準偏差，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，兩種方法測定結(jié)果的平均值相差不是很大，但是內(nèi)標法精密度遠優(yōu)于外標法。由于表中數(shù)據(jù)為分析5次的統(tǒng)計結(jié)果，但是日常分析中一般為2次平行測定，所以相對標準偏差還要大。建議在條件允許的情況下，應(yīng)盡量使用內(nèi)標法測定腦蛋白水解物注射液中的氨基酸含量。

3 結(jié)語

該法與傳統(tǒng)氨基酸測定方法相比，分析時間縮短1倍以上，并提高了檢測的靈敏度和準確性，適用于腦蛋白水解物注射液中氨基酸含量的快速測定。

表4 內(nèi)標法和外標法樣品測定結(jié)果分析

續(xù)表4

氨基酸Ⅰ內(nèi)標法(X—±SD)/mg·mL-1RSD/%外標法(X—±SD)/mg·mL-1RSD/%Ⅱ內(nèi)標法(X—±SD)/mg·mL-1RSD/%外標法(X—±SD)/mg·mL-1RSD/%Ⅲ內(nèi)標法(X—±SD)/mg·mL-1RSD/%外標法(X—±SD)/mg·mL-1RSD/%蘇氨酸0．34±0．024．810．31±0．026．450．38±0．024．750．41±0．024．880．39±0．024．130．42±0．025．16精氨酸1．05±0．022．241．14±0．065．140．91±0．033．301．04±0．054．651．03±0．033．110．94±0．044．41丙氨酸2．81±0．062．122．75±0．114．003．26±0．072．143．19±0．144．392．68±0．082．872．74±0．103．87纈氨酸1．77±0．042．231．78±0．063．372．25±0．052．222．20±0．074．181．84±0．052．921．92±0．094．91蛋氨酸0．58±0．023．920．47±0．036．500．44±0．024．550．49±0．035．330．46±0．024．250．42±0．025．35色氨酸0．63±0．034．240．61±0．045．550．46±0．024．340．50±0．035．240．60±0．023．380．63±0．045．49苯丙氨酸1．81±0．062．351．83±0．053．402．23±0．052．342．29±0．093．931．90±0．063．141．85±0．063．23異亮氨酸1．79±0．042．381．82±0．094．952．20±0．041．822．27±0．093．961．93±0．042．051．83±0．073．88亮氨酸5．30±0．111．985．35±0．162．996．89±0．101．506．79±0．192．805．84±0．142．415．78±0．173．06賴氨酸5．23±0．193．715．20±0．193．926．22±0．152．416．31±0．213．505．21±0．194．025．30±0．205．22脯氨酸2．22±0．104．542．41±0．145．752．36±0．114．662．45±0．135．311．67±0．084．981．71±0．105．54

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