宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠胰腺肝臟骨骼肌中胰島素受體底物的表達

李 瑤 辛 穎

宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)，一般指出生體重低于同胎齡、同性別平均出生體重的P10或同胎齡、同性別平均出生體重2個標準差以下的新生兒[1]。近10年來的流行病學調(diào)查結果顯示，出生體重與成年后的冠心病、高血壓和2型糖尿病有密切關系，其中2型糖尿病和高血壓是代謝綜合征的組分，與脂代謝異常、肥胖和胰島素抵抗密切相關，而代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)是胰島素抵抗[2]。本研究建立大鼠IUGR模型[3]，采集IUGR模型鼠產(chǎn)下仔鼠不同時點胰腺、肝臟和骨骼肌組織，以RT-PCR和Western blot技術檢測胰島素受體底物1(IRS-1)和IRS-2表達水平，其中胰腺組織的相關檢測結果顯示，IRS-2 mRNA表達和蛋白水平顯著下降[4]，提示IRS-2是調(diào)控胰島β細胞生長發(fā)育的主要受體物質(zhì)；IUGR個體從出生后至成年期胰腺組織可能存在IRS-2信號轉(zhuǎn)導障礙。本研究進一步檢測肝臟和骨骼肌組織的ISR-1和ISR-2 mRNA和蛋白表達水平，探討外周組織是否存在胰島素信號轉(zhuǎn)導障礙，并與胰腺組織相關結果進行比較，分析胰腺和外周組織胰島素抵抗的差異。

1 方法

1.1 儀器、試劑和IUGR大鼠模型制備 本研究所使用的儀器、試劑以及實驗動物同文獻[4]。予大鼠孕期低蛋白飼料喂養(yǎng)制備IUGR模型，以模型鼠產(chǎn)下的仔鼠為IUGR組；以孕期予正常飲食的母鼠產(chǎn)下的仔鼠為對照組，具體方法參見文獻[4]。所有孕鼠均自然分娩，稱量新生仔鼠體重精確至0.01 g。IUGR仔鼠判斷標準：新生鼠出生體重低于對照組平均出生體重的2個標準差[1]。符合IUGR的仔鼠保留。

1.2 標本采集 兩組仔鼠以母乳喂養(yǎng)，母鼠均飼以標準飼料。IUGR組和對照組仔鼠滿3周后斷乳，分籠飼養(yǎng)，均飼以標準飼料，觀察兩組仔鼠的發(fā)育情況，記錄每周體重。兩組以出生后0、3和8周為觀察時點，各選取8只仔鼠。于出生后(0周)立即處死并留取胰腺、肝臟和骨骼肌組織；3和8周時點采集標本前禁食12 h，次日晨以摘眼球法采血，分離血清，隨后處死仔鼠并留取胰腺、肝臟和骨骼肌組織。均置于-70℃冰箱保存。

1.3 ISR-1和ISR-2 mRNA和蛋白表達水平檢測 大鼠IRS-1，IRS-2和內(nèi)參照β-actin引物參照Gene Bank中的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。分別稱取100 mg胰腺、肝臟和骨骼肌組織，用Trizol試劑抽提RNA，以RT-PCR法分析IRS-1、IRS-2 mRNA的表達水平。采用Western blot技術檢測IRS-1和IRS-2蛋白的表達水平。具體的操作步驟見文獻[4]。

1.4 空腹血糖和血清胰島素測定 ①空腹血糖：采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定。②血清胰島素測定：按說明書要求處理試劑，配制洗液；加入100 μL的標準品于空白微孔中；分別標記血清樣品編號，加入100 μL的樣品于空白微孔中；在標準品孔和樣品孔中加入50 μL的酶標記溶液；37℃恒溫水浴箱水浴60 min;洗扳機清洗5次，每次靜置10 s;每孔加入底物A、B液各50 μL，37℃恒溫避光孵育15 min,加入50 μL終止液終止反應，在450 nm波長下以酶標儀讀取各孔A值，計算胰島素含量。

1.5 空腹胰島素抵抗指數(shù)(FIRI)計算公式如下：

其中FPG為空腹血糖，F(xiàn)INS為空腹胰島素。

2 結果

2.1 孕期低蛋白對仔鼠生長發(fā)育的影響 IUGR組和對照組孕鼠平均孕期和產(chǎn)仔數(shù)無顯著差異。IUGR組出生體重顯著低于對照組，(3.92±0.22)gvs(4.94±0.32)g。3周時點 IUGR 組平均體重仍顯著低于對照組，(27±4)gvs(35±4)g；8周時點IUGR組體重顯著高于對照組，(160±17)gvs(139±8)g。

2.2 胰腺、 肝臟和骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達水平比較 RT-PCR結果顯示， IUGR組胰腺、肝臟IRS-1 mRNA和蛋白表達水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義；IUGR組0、3和8周時點骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著低于對照組(P<0.01)(表1，圖1和圖2A)。 至8周時點，骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達水平的下降幅度較胰腺和肝臟組織明顯。

2.3 胰腺、肝臟和骨骼肌IRS-2 mRNA和蛋白表達水平比較 表2顯示，IUGR組0、3和8周時點，胰腺、肝臟IRS-2 mRNA和蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；骨骼肌IRS-2 mRNA和蛋白表達水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義。肝臟IRS-2 mRNA和蛋白表達水平的下降幅度較胰腺明顯(表2，圖1和圖2B)。

2.4 兩組糖代謝的比較 兩組仔鼠3周時點的空腹血糖、胰島素水平及FIRI差異無統(tǒng)計學意義；8周時點與對照組比較，IUGR組空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義，胰島素水平和FIRI顯著升高(表3)。

GroupIRS-1mRNA0week3weeks8weeksIRS-1protein0week3weeks8weeksPancreasControl(n=8)1.04±0.081.03±0.081.03±0.08101±7104±8105±8IUGR(n=8)1.0±0.070.96±0.071.02±0.0799±7102±8104±8t1.0330.7540.40.520.50.25P0.10.40.50.50.50.5LiverControl(n=8)1.0±0.081.04±0.081.03±0.08124±9133±9125±10IUGR(n=8)1.0±0.051.03±0.081.01±0.08119±9129±8122±10t00.350.711.130.90.61P0.50.50.50.20.40.5SkeletalmuscleControl(n=8)1.1±0.071.05±0.071.09±0.08137±10135±10135±10IUGR(n=8)0.91±0.070.93±0.060.74±0.07111±12104±996±7t5.423.693.834.766.689.15P0.0010.0050.0020.0010.0010.001

GroupIRS-2mRNA0week3weeks8weeksIRS-2protein0week3weeks8weeksPancreasControl(n=8)1.13±0.081.11±0.091.08±0.06155±11151±11155±13IUGR(n=8)0.98±0.070.83±0.060.79±0.06138±10121±9110±8t47.369.933.3268.57P0.0020.0010.0010.0050.0010.001LiverControl(n=8)1.0±0.071.02±0.081.1±0.07171±10171±12174±12IUGR(n=8)0.85±0.070.73±0.060.69±0.05136±9126±9103±8t4.228.2116.667.187.1814.2P0.0010.0010.0010.0010.0010.001SkeletalmuscleControl(n=8)1.17±0.261.07±0.071.1±0.07115±8114±8113±8IUGR(n=8)1.0±0.0811.0±0.071.03±0.08112±8113±9104±8t1.821.840.750.230.74P0.10.10.10.40.50.4

表3 IUGR組和對照組不同時點空腹血糖、血清胰島素水平和FIRI比較

圖1 IUGR組和對照組不同時點胰腺、肝臟和骨骼肌的IRS-1、IRS-2 mRNA的表達

Fig 1 IRS-1 and IRS-2 mRNA expression in pancreas, liver and skeletal muscle of rats at 0, 3 and 8 week

Notes w: week; 1-6: pancreas; 7-12: liver; 13-18: skeletal muscle

圖2 IUGR組和對照組不同時點胰腺、肝臟、骨骼肌的IRS-1、IRS-2蛋白表達

Fig 2 IRS-1 and IRS-2 protein expression in pancreas, liver and skeletal muscle of rats at 0, 3 and 8 week

Notes w: week; A: IRS-1 protein expression; B: IRS-2 protein expression

3 討論

近年來IUGR與成年期以胰島素抵抗為特征的代謝性綜合征的關系成為研究熱點[5]。胰島素抵抗可由胰島素受體缺陷所致。ISR蛋白是多種受體信號傳導蛋白的底物，胰島素受體底物與磷酸化的胰島素受體β亞基結合后，作為船塢蛋白，其酪氨酸殘基的磷酸化為下游的信號蛋白提供了一個高親和力的結合位點，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路促進細胞攝取葡萄糖及促進細胞的生長和增殖[6]。本實驗結果顯示，雌性大鼠孕期低蛋白飲食所致IUGR仔鼠8周時點體重顯著高于對照組，出現(xiàn)肥胖傾向，胰島素水平和FIRI顯著高于對照組，提示出現(xiàn)了胰島素抵抗。

IRS-1主要在骨骼肌表達，促進肌肉攝取利用葡萄糖。IRS-2大量表達于肝臟和胰腺β細胞，促進肝臟糖原合成和抑制肝葡萄糖輸出；作為調(diào)節(jié)β細胞功能的重要信號分子，IRS-2主要調(diào)節(jié)β細胞增殖、生長和存活[7]。本研究進一步分析了IRS-1、IRS-2 mRNA和蛋白在胰腺、肝臟和骨骼肌組織的表達，結果顯示IUGR組在出生后0、3和8周時點胰腺和肝臟組織IRS-2 mRNA和蛋白表達水平顯著低于對照組，骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達水平顯著低于對照組，提示IUGR個體從出生后至成年期不僅存在胰腺組織胰島素信號通路轉(zhuǎn)導障礙，還可能存在外周組織胰島素信號通路轉(zhuǎn)導障礙。

肝臟在機體能量平衡尤其糖脂代謝中發(fā)揮關鍵作用，肝臟胰島素抵抗在2型糖尿病中起主導作用[8]。肝臟發(fā)生胰島素抵抗時，可導致糖異生和肝糖元輸出增加，引起空腹高血糖和高胰島素血癥；此外胰島素抑制內(nèi)臟和皮下脂肪動員，促進脂肪酸氧化的作用減弱，使得進入肝臟的游離脂肪酸水平增加，作用于肝細胞內(nèi)的胰島素信號傳導途徑，而加重肝臟胰島素抵抗[9]。本研究結果顯示，肝臟組織ISR-2 mRNA和蛋白水平顯著低于胰腺和骨骼肌，提示肝臟在胰島素抵抗中可能發(fā)揮較大作用。

本研究IUGR大鼠在3周時點，胰島素水平和FIRI較對照組無顯著升高，但已可觀測到胰腺、肝臟IRS-2 mRNA和蛋白表達水平，骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達水平的降低，提示可能出現(xiàn)胰島素抵抗的傾向。8周時點觀測到胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)的升高，提示出現(xiàn)胰島素抵抗，而該時點胰腺和肝臟中IRS-2 mRNA和蛋白水平、骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白水平均較低，進一步證實了胰島素抵抗與IRS-1、IRS-2 mRNA和蛋白表達有關。

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