脈沖場(chǎng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題及解決方案

陳秋芳,焦湞,押輝遠(yuǎn)

（1.鄭州大學(xué)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450052；2.洛陽(yáng)師范學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471022）

脈沖場(chǎng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題及解決方案

陳秋芳1,焦湞1,押輝遠(yuǎn)2

（1.鄭州大學(xué)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450052；2.洛陽(yáng)師范學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471022）

脈沖場(chǎng)凝膠電泳是分離大分子DNA片段的有效方法.就脈沖場(chǎng)凝膠實(shí)驗(yàn)中遇到的問(wèn)題及解決方法進(jìn)行了探討,在充分理解實(shí)驗(yàn)原理的基礎(chǔ)上對(duì)脈沖場(chǎng)凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,最終達(dá)到利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳得到大分子DNA片段清晰整齊電泳條帶的實(shí)驗(yàn)效果,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ).

脈沖電泳；大分子DNA；條件優(yōu)化

脈沖凝膠電泳（pulsed field gelelectrophoresis,PFGE）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種分離大片段DNA的電泳技術(shù),在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用[1-3].普通的瓊脂糖凝膠電泳是借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用,核酸片段因其分子量或分子形狀不同,電泳移動(dòng)速度有差異而分離,然而這項(xiàng)技術(shù)只能分離15～20 kb以下的小分子DNA以及質(zhì)粒DNA分子,更大的DNA分離用普通瓊脂糖凝膠電泳無(wú)法達(dá)到分離的目的,從而限制了染色體DNA的分離、生物物種鑒定、微生物基因分型、人類染色體內(nèi)切酶物理圖譜分析等方面的研究.1984年,Schwartz和Centor發(fā)明了脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù),并成功實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母菌細(xì)胞16條染色體DNA的分離[4].目前PEGE技術(shù)可以分離1～10Mb的DNA片段,為真核生物染色體DNA或大片段DNA的研究提供了新的工具,已經(jīng)在生物物種的鑒定、核型分析以及生物基因組結(jié)構(gòu)的研究方面的到廣泛應(yīng)用[5-7].本文簡(jiǎn)述了PEGE的原理,并在實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)引導(dǎo)學(xué)生優(yōu)化了利用PFGE分離小麥BAC質(zhì)粒限制性酶切片段的實(shí)驗(yàn)方法,為進(jìn)行下一步的Southern雜交實(shí)驗(yàn)、達(dá)到進(jìn)行更加精細(xì)的遺傳圖譜分析以及同源性檢查的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡於ɑA(chǔ).

1 PEGE的原理

瓊脂糖凝膠電泳利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)可以分離20 kb以下的DNA分子片段.大于20 kb的線性DNA雙鏈片段,在電場(chǎng)作用下通過(guò)孔徑小于分子大小的凝膠時(shí),將會(huì)改變無(wú)規(guī)卷曲的構(gòu)象,沿電場(chǎng)方向伸直,與電場(chǎng)平行從而才能通過(guò)凝膠.此時(shí),大分子通過(guò)凝膠的方式相同,遷移率無(wú)差別,不能分離.PFGE采用了兩個(gè)交變電場(chǎng),即兩個(gè)電場(chǎng)交替的開(kāi)啟和關(guān)閉,當(dāng)某一電場(chǎng)開(kāi)啟時(shí), DNA分子即順著此電場(chǎng)的方向拉長(zhǎng)和延展,以“爬行”的方式穿過(guò)凝膠孔.如果電場(chǎng)方向改變,DNA分子必須先掉轉(zhuǎn)頭來(lái),才能沿著新的電場(chǎng)方向泳動(dòng).較小的分子位移的時(shí)間相對(duì)減少,較大的分子則需要較多的時(shí)間來(lái)改變方向,從而將不同大小的分子分開(kāi).人們用稀有位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌的染色體DNA進(jìn)行消化,得到較大的片段,然后進(jìn)行PFGE電泳,可將不同大小DNA片段分開(kāi),穩(wěn)定性好,分辨率高.

2 PEGE的應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 從小麥品種小偃54構(gòu)建的DNA BAC文庫(kù)篩選到的特定基因的BAC克隆,編號(hào)為838-5-3,907-5-16,907-7-15,1257-1-11,1258-1-16.

2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 美國(guó)伯樂(lè)公司（BIO-RAD）的CHEF-DRⅢ脈沖電泳儀（Richmond,California）.Marker為λHindⅢ.質(zhì)粒提取采用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Qiagene的質(zhì)粒提取試劑盒兩種方法提取.

2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 取適量的BACDNA及限制性內(nèi)切酶（1μg BACDNA,3單位限制性內(nèi)切酶）,在適宜溫度培養(yǎng)3～4 h.限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ購(gòu)自大連寶生物.取適量酶切后的BAC質(zhì)粒DNA在脈沖電泳儀中電泳,將DNA酶切產(chǎn)物電泳瓊脂糖凝膠置于EB中染色20min,蒸餾水清洗10～15min.在凝膠成像系統(tǒng)下掃描,存圖.

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)粒提取 從節(jié)約成本的角度出發(fā),首先用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ提取的質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)酶切后（30μL體系）,全部點(diǎn)樣,脈沖電泳后沒(méi)有條帶,可能用這種方法提取的質(zhì)粒純度較低,酶切量少.然后用Qiagene的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,純度高較高（見(jiàn)圖1）,適宜用于下一步的酶切及電泳分離.

圖1 試劑盒提取的BAC質(zhì)粒電泳照片

2.2.2 脈沖電泳實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 選用BamHⅠ對(duì)于提取的5個(gè)BAC克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切,根據(jù)詹勇華等的電泳條件[8],實(shí)驗(yàn)開(kāi)始采用的脈沖電泳條件是：16 h,1%瓊脂糖凝膠,0.5×TBE,溫度14℃,電場(chǎng)夾角120°,起始脈沖時(shí)間5 s,終止脈沖時(shí)間15 s,電壓6 V/cm.圖2 A顯示了這些BAC克隆酶切后脈沖電泳的效果.從圖2A可以看出,脈沖電泳的酶切條帶有些彎曲,條帶分離得不好,而且不夠清晰.為此,實(shí)驗(yàn)調(diào)整了脈沖電泳的電場(chǎng)強(qiáng)度,從6 V/cm降為5 V/cm,時(shí)間從16 h縮短到12 h,其他條件不變,再次對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳分離（圖2 B）,從圖2可以看出,用5 V/cm的脈沖場(chǎng)電場(chǎng)可以獲得清晰的電泳分離條帶,為下一步的Southern雜交實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ).

圖2 小麥5個(gè)BAC克隆質(zhì)粒的BamHⅠ酶切脈沖電泳照片

為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的可靠性,選用NotⅠ酶切篩選到的5個(gè)BAC質(zhì)粒,用優(yōu)化后的方法進(jìn)行脈沖電泳分離,同樣可以得到清晰的電泳條帶（見(jiàn)圖3）.因此,經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的脈沖實(shí)驗(yàn)條件是：12 h,1%瓊脂糖凝膠,0.5×TBE,溫度14℃,電場(chǎng)夾角120°,起始脈沖時(shí)間5 s,終止脈沖時(shí)間15 s,電壓5 V/cm.這樣的脈沖實(shí)驗(yàn)條件可以很好地分離小麥BAC質(zhì)粒的酶切片段.

3 討論

圖3 小麥5個(gè)BAC克隆質(zhì)粒的NotⅠ酶切脈沖電泳照片

PFGE作為一種有效的分離大片段DNA的電泳方法在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用.因此如何掌握這門實(shí)驗(yàn)技能,以及根據(jù)脈沖電泳的實(shí)驗(yàn)原理解決實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的問(wèn)題至關(guān)重要.筆者認(rèn)為在脈沖電泳實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意一下幾個(gè)方面的問(wèn)題：

（1）配制瓊脂糖膠時(shí),可以根據(jù)需要分離的DNA片段的大小來(lái)調(diào)節(jié)瓊脂糖膠的濃度；在倒完瓊脂糖膠后用75%的酒精噴膠面,可以防止膠面有氣泡.

（2）定時(shí)更換新的緩沖溶液,更換緩沖溶液要時(shí)盡可能小心不要碰壞瓊脂凝膠.

（3）確保電泳槽是水平的.如果不水平,調(diào)整槽底部的旋鈕,注意不要觸碰電極.

（4）電泳開(kāi)始前,打開(kāi)主機(jī)和泵的開(kāi)關(guān),確保電泳緩沖溶液在冷卻泵的作用下在管道中正常循環(huán)流動(dòng),等電泳緩沖溶液溫度降到設(shè)定的14℃再把點(diǎn)樣后的瓊脂糖凝膠放進(jìn)電泳槽中電泳.

（5）較低的脈沖電場(chǎng)電壓能夠產(chǎn)生較整齊的條帶,可以根據(jù)需要分離的DNA分子大小來(lái)適當(dāng)調(diào)節(jié)電場(chǎng)強(qiáng)度,大的DNA分子需要較低的電場(chǎng)強(qiáng)度.

（6）脈沖電泳時(shí)間根據(jù)所需分離的DNA分子大小確定.

總之,分離較大的DNA分子需要較小的瓊脂糖膠濃度、較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換時(shí)間、較低的電場(chǎng)強(qiáng)度、較低的電場(chǎng)角度、較長(zhǎng)的電泳運(yùn)行時(shí)間,較低的緩沖溶液溫度可以得到較為清晰的電泳條帶,學(xué)生只有徹底理解脈沖電泳的實(shí)驗(yàn)原理,才能在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中就遇到的問(wèn)題提出切實(shí)可行的解決策略和實(shí)驗(yàn)方案.

[1]Kato H,Kato N,Watanabe K,et al.Application of typing by pulsed-field gelelectrophoresis to the study ofClostridium difficilein aneonatal intensive careunit[J].JClin Microbiol,1994,32：2067-2070.

[2]Davis A,Hancock D D,Besser TE,et al.Evaluation of pulsed field gel electrophoresis as a tool for determining the degree of genetic relatednessbetween stainsofEscherichia coliO157：H7[J].JClin Microbol,2003,41（5）：1843-1849.

[3]Yin LF,Luo CX,KusabaM,et al.Analysisof theabnormalsegregation ofpathogenicity inMagnaporthe grise aby usinga genetic crossofOryzaandEleusineisolates[J].AgriculturalSciences in China,2010,9（3）：383-391.

[4]Schwartz D C,Cantor C R.Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis[J].Cell, 1984,37（1）：67-75.

[5]Talbot N J,Oliver R P,Coddington A.Pulsed field gel electrophoresis reveals chromosome length differences between strains ofCladosporium fulvum（syn.Fulvia fulva）[J].MolGen Genet,1991,229：267-272.

[6]Orbach M J,Chum ley F G,Valent B.Electrophoretic karyotypes ofMagnaporthe griseapathogens of diverse grasses[J].Mol Plant-Microbe Interact,1996,9：261-271.

[7]付曉燕,胡克興,范黎.脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)及其在真菌學(xué)研究中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2006,33（1）：144-147.

[8]詹勇華,陳創(chuàng)夫,高劍鋒,等.脈沖場(chǎng)凝膠電泳在BAC文庫(kù)插入片段分析中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2006（2）：32-33.

Discussion on the problem s and countermeasures in the pulsed field gel electrophoresis experiment

Chen Qiufang1,Jiao Zhen1,Ya Huiyuan2
（1.Henan ProvincialKey Laboratory of Ion Beam Bio-engineering,Zhengzhou University, Zhengzhou 450052,China；2.College of Life Sciences Luoyang,NormalUniversity,Luoyang 471022,China）

Pulsed field gel electrophoresis（PFGE）is an effective technique of gel electrophoresis which can be used to separate large DNA.This paper discusses the solutions to the problems encountered in the process of pulsed field gel electrophoresis experimental teaching.The pulsed field gel electrophoresis experiment parameters are optimized on the basis of fully understanding the principle of PFGE.Eventually,we can use the pulse field gel electrophoresis to get the better electrophoresis bands ofmacromolecular DNA fragments.Thiswill lay the foundations for a further research.

pulsed field gel electrophoresis,large DNA,optimization of experimental parameters

Q503

A

1008-7516（2011）05-0055-03

10.3969/j.issn.1008-7516.2011.05.014

2011-07-23

國(guó)家自然科學(xué)基金（30800204）

陳秋芳（1972-）,女,河南伊川人,博士,工程師.主要從事離子束生物工程研究.

盧奇）