應(yīng)用HS-SPME技術(shù)分析葡萄果皮與果肉揮發(fā)性香氣物質(zhì)*

范文來，徐巖，李記明，，姜文廣，，于英

1(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江南大學釀酒科學與酶技術(shù)研究中心，釀造微生物與應(yīng)用酶學研究室，江蘇無錫，214122)2(張裕集團公司技術(shù)中心，山東煙臺，264000)

揮發(fā)性香氣成分是葡萄中重要的風味物質(zhì)，其種類繁多，主要包括酸類、醇類、酯類、萜烯類、醛酮類和酚類等［1］。這些成分的種類、含量、感覺閾值及其之間的相互作用決定著葡萄的感官質(zhì)量，也影響著葡萄酒的風味和典型性［2］。不同葡萄品種，乃至同一品種不同品系、不同成熟期和不同產(chǎn)地之間風味成分存在著差異。蛇龍珠(Cabernet gernischt)、赤霞珠(Cabernet sauvignon)、品麗珠(Cabernet franc)和梅鹿輒(Merlot)葡萄是我國釀造紅葡萄酒的主要葡萄品種，我國科研人員對這些葡萄品種的香氣研究十分廣泛，而對蛇龍珠葡萄的研究相對較少［2－3］。

紅葡萄酒發(fā)酵是帶皮發(fā)酵，其主要目的是浸出皮中的色素和丹寧［4］。近期的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄皮中除了含有大量的色素和丹寧外，還含有大量的風味化合物［5］。Cabaroglu等人研究了麝香葡萄(Muscat)酒的游離與結(jié)合態(tài)風味，并對浸皮發(fā)酵時間進行了研究，發(fā)現(xiàn)浸皮發(fā)酵時能增加總游離與結(jié)合態(tài)風味化合物濃度［6］。Sánchez-Palomo 等人應(yīng)用頂空-固相微萃取(HS–SPME)方法快速檢測麝香葡萄的葡萄汁和果皮揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)里哪醇、香葉醇、橙花醇含量最高［7］。Cabrita等人曾經(jīng)應(yīng)用酶和酸水解法研究了包括10個葡萄品種(5個白葡萄和5個紅葡萄品種)的果皮與果肉的結(jié)合態(tài)香氣成分，認為葡萄果皮比果肉含有更多的香氣成分［8］。Murat等人在研究赤霞珠和梅鹿輒葡萄中3-甲硫基-1-己醇(3MH)及其前驅(qū)物時發(fā)現(xiàn)，該化合物60%存在于葡萄皮中;延長果汁與果皮接觸時間可以增加果汁中3MH的濃度，溫度升高有利于3MH的浸出［9］。

由于大多數(shù)的揮發(fā)性物質(zhì)在葡萄中的含量很低，因此在應(yīng)用色譜-質(zhì)譜技術(shù)對其進行定性、定量分析前，有必要采用適宜的濃縮富集手段對樣品進行預(yù)處理。傳統(tǒng)的富集手段包括液液萃?。?0］、固相萃?。?1］、頂空技術(shù)［12］、吹掃捕集技術(shù)［13］、超臨界流體萃?。?4］和溶劑蒸餾萃?。?5］等。這些預(yù)處理手段都存在一定的缺點，有些耗時費力，有些涉及到有毒的有機溶劑，有些需使用昂貴的設(shè)備［16］。1990年，Pawliszyn等人［17］研發(fā)出了固相微萃取技術(shù)(簡稱SPME)。目前，該技術(shù)已經(jīng)在酒類分析檢測中得到廣泛應(yīng)用［2，18－19］。

與國外略有不同的是，我國釀酒葡萄以蛇龍珠、赤霞珠、品麗珠和梅鹿輒為主，特別是我國特有的品種蛇龍珠研究較少。為明晰我國主要釀酒葡萄的風味成分，特別是果皮與果肉的風味成分，應(yīng)用 HSSPME技術(shù)對這4種葡萄的果皮與果肉成分進行研究，以便對紅葡萄酒的浸皮發(fā)酵提供技術(shù)指導，提高我國國產(chǎn)葡萄酒的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

1.1.2 試劑

主要試劑包括乙酸乙酯(99%)，丁酸乙酯(99%)，2-甲基丁酸乙酯(99%)，正丁醇(99%)，3-甲基丁醇(99%)，己酸乙酯(99%)，己醇(99%)，順-3-己烯-1-醇(99%)，辛酸乙酯(99%)，乙酸(99%)，2-乙基-1-己醇 (99%)，苯甲 醛 (99%)，正 辛醇(98%)，癸酸 乙酯 (99%)，萘 (99%)，苯乙 酮(99%)，苯甲酸乙酯(99%)，正癸醇(98%)，香茅醇(98%)，己酸 (99%)，苯甲醇 (99%)，γ-壬內(nèi)酯(98%)，對乙基苯酚(98%)，3-甲基丁醛(97%)，乙偶姻(98%)，1-辛烯-3-醇(98%)，里哪醇(98%)，順，反-2，6-壬二烯醛(98%)，4-萜品醇(99%)，苯乙醛(97%)，正壬醇(98%)，α-萜品醇(98%)，2-羥基苯甲酸甲酯(97%)，β-苯乙酸乙酯(99%)，茴香腦(97%)，β-大馬酮(98%)，β-紫羅蘭酮(99%)，苯酚(98%)，4-甲基苯酚(96%)，苯甲酸(97%)，香草醛(98%)和乙酰香草酮(98%)購自Sigma-Aldrich公司(St．Louis，MO，USA)。2-辛醇 (96%)，異戊酸(98%)，2-苯乙醇(99%)購自 Fluka 公司(Bush，Switzerland)。異丁酸(99%)購自 Alfa Aesar公司(Ward Hill，MA，USA)。辛酸(98%)購自吳江慈云香料香精有限公司。乙醇購自美國 TEDIA試劑公司，液相色譜純。己醛(98%)，癸醛(99%)購自北京北大正元科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N-5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司;50 μm/30 m CAR/DVB/PDMS(2 cm)萃取頭，美國Supelco公司;SPME手動進樣手柄，美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

1.3.1.1 葡萄果皮

?。?0℃儲藏的葡萄樣品100 g，在冷凍狀態(tài)下用手撥下葡萄皮，用去離子水輕輕沖去果皮上附著的果肉和果汁，用濾紙吸干葡萄皮上的水分。稱取2 g葡萄皮裝入50 mL的磨口三角瓶中，再加入10 mL模擬葡萄汁(煮沸去離子水中用酒石酸調(diào)pH3.5)，超聲波浸取一定時間，然后取8 mL葡萄汁到15 mL的棕色頂空瓶中，加 2.4g NaCl、4 μL 2-辛醇(內(nèi)標)，蓋緊頂空瓶蓋，用于GC-MS檢測。

1.3.1.2 葡萄果肉

在互聯(lián)網(wǎng)社會，其最突出的特點就是整合了產(chǎn)業(yè)鏈的各種特色。以運營商為中心，產(chǎn)業(yè)鏈中的每一個廠商都有屬于自己的業(yè)務(wù)，同時也在向上游、下游延伸和滲透，每個廠商的定位越來越模糊。而諾基亞卻沒能夠抓住這一點，其沒有主動與產(chǎn)業(yè)鏈中的各個環(huán)節(jié)主動合作，也就沒能形成自己的影響力。

?。?0℃儲藏的葡萄樣品100 g，在冷凍狀態(tài)下用手撥下葡萄皮，果肉中加1 g CaCl2和少許液氮進行破碎，破碎后4℃下5 000 r/min離心10 min，然后取8 mL葡萄汁加入到15 mL的棕色頂空瓶中，加2.4 g NaCl和 4 μL 2-辛醇(內(nèi)標)，蓋緊頂空瓶蓋，用于GC-MS檢測。

1.3.2 標準溶液配制

準確稱取一定量標準品配制到無水乙醇(優(yōu)級純，上海國藥集團)中配成一定濃度的標準樣品，再加入到模擬葡萄汁中配制成一系列濃度的標準混合溶液。模擬葡萄汁采用煮沸的去離子水配制，用酒石酸將pH值調(diào)整到3.5。內(nèi)標溶液為2-辛醇溶于無水乙醇中。

1.3.3 HS-SPME與定量方法

HS-SPME萃取條件與定量方法采用Fan等人的方法［2］，萃取時采用 CAR/DVB/PDMS三相萃取頭，預(yù)熱5 min，60℃下萃取45 min。

1.3.4 GC-MS

GC條件:色譜柱為DB-Wax(30 m ×0.25 mm× 0.25 μm，Agilent)。進樣口溫度 250℃，載氣 He，流速2 mL/min，檢測器溫度250°C。程序升溫:初始溫度50°C保持1 min，以6°C/min的速度升溫至230 °C，保持 15 min，溶劑延遲3 min。

MS條件:EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 °C，掃描范圍33.00～500.00 amu。

1.3.5 甲氧基吡嗪檢測方法

甲氧基吡嗪的測定參照文獻［20］。

1.3.6 物質(zhì)鑒定及定量分析

物質(zhì)定性采用將未知物的圖譜與NIST Library和Wiley Library庫相比較，保留匹配度大于800(最高值為1000)的物質(zhì)作為化合物定性鑒定結(jié)果。除此以外，檢索結(jié)果還與已報道的保留時間進行對比驗證。

定量時每種待測物質(zhì)分別對應(yīng)于內(nèi)標作標準曲線，經(jīng)過GC-MS檢測后利用待測物質(zhì)和內(nèi)標的相對峰面積比代入相對應(yīng)的標準曲線方程計算出待測物質(zhì)的含量。每種待測物質(zhì)的峰面積采用選擇離子方法積分(SIM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄果皮中風味物質(zhì)超聲波輔助萃取

果皮中含有大量風味化合物，但浸出困難。為縮短浸出時間，采用超聲波輔助浸出，樣品分別超聲10、20、30和40 min，研究超聲時間對浸出效果的影響。結(jié)果如圖1所示，在20 min后香氣成分的總峰面積基本趨于平衡。因此，果皮浸出時間設(shè)定為超聲波輔助萃取20 min。

圖1 葡萄果皮超聲浸提時間的優(yōu)化

2.2 葡萄果皮與果肉風味化合物總量

在4種葡萄中，果皮中的化合物總量高于果肉中的化合物總量(見表1)，這一結(jié)果與 Selir［21－22］和 Cabrita［8］的研究結(jié)果是一致的。就研究的10類化合物總量而言，果皮的含量是果肉的1.64～21.07倍。果皮中含有較多的酯類、芳香族化合物、揮發(fā)性有機酸和揮發(fā)酚，這些化合物果皮比果肉中高出10倍以上。

不同品種的葡萄中，果皮中高含量化合物是不一樣的。在所研究的4種葡萄中，赤霞珠葡萄果皮中化合物含量較高，而蛇龍珠葡萄的果皮與果肉成分相差較小。梅鹿輒葡萄的果皮中含有較多的酯類與芳香族化合物;赤霞珠葡萄果皮中含有大量的揮發(fā)性有機酸和揮發(fā)酚;品麗珠葡萄中含有較多的揮發(fā)酚、芳香族化合物和揮發(fā)性有機酸;而蛇龍珠葡萄果皮中主要是芳香族化合物。

表1 四種葡萄果皮與果肉風味化合物濃度比

2.3 葡萄果皮與果肉中的主要揮發(fā)性風味化合物

不同的風味化合物在葡萄果皮與果肉中含量差別較大。葡萄果皮中含有較多的辛酸乙酯、2-己烯酸甲酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、辛醛、癸醛、異戊醇、苯甲醛、萘、乙酰苯、水楊酸甲酯、乙酸、里哪醇、茴香腦、己醛、2-己烯醛、順-3-己烯-1-醇、苯酚和 3-異丁基-2-甲氧基吡嗪(見表2)。

表2 四種葡萄果皮和果肉中香氣成分的含量(g/100 g)

續(xù)表2

不同品種葡萄果皮中主要風味成分濃度是不一樣的。梅鹿輒葡萄果皮中含有較多的辛酸乙酯、2-己烯酸甲酯、癸酸乙酯、己酸乙酯，是果肉的10倍以上;赤霞珠與品麗珠葡萄皮中含有較多的乙酸;梅鹿輒與赤霞珠葡萄皮中含有較多的癸醛，而品麗珠葡萄皮中含有較多的辛醛;梅鹿輒與品麗珠葡萄皮中含有大量的異戊醇;苯甲醛主要存在于梅鹿輒、赤霞珠和品麗珠葡萄的皮中;而乙酰苯和水楊酸甲酯主要存在于梅鹿輒、品麗珠與蛇龍珠葡萄果皮中，果肉中相對較少。對萜烯類化合物而言，里哪醇大量存在于赤霞珠葡萄的果皮中，而茴香腦、(S)-3-乙基-4-甲基戊醇、萘在研究的4種葡萄皮中含量遠高于果肉(10倍以上)。3-異丁基-2-甲氧基吡嗪主要存在于品麗珠與蛇龍珠葡萄果皮中。

3 結(jié)論

通過對蛇龍珠、赤霞珠、梅鹿輒和品麗珠4種葡萄果肉和果皮中香氣成分的定量和定性分析，結(jié)果表明果皮中各香氣成分的含量大約是果肉中的1.58～20.54倍左右。果皮中含有較多的酯類、芳香族化合物、揮發(fā)性有機酸和揮發(fā)酚。

與果肉成分相比，梅鹿輒葡萄果皮中主要含有辛酸乙酯、2-己烯酸甲酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、癸醛、異戊醇、苯甲醛、乙酰苯、水楊酸甲酯和2-己烯醛。赤霞珠葡萄皮中含量高的化合物有癸醛、苯甲醛、乙酸、里哪醇和順-3-己烯-1-醇。品麗珠葡萄皮中主要有辛醛、異戊醇、苯甲醛、乙酰苯、水楊酸甲酯、乙酸、2-己烯醛和3-異丁基-2-甲氧基吡嗪;而蛇龍珠葡萄果皮中主要是水楊酸甲酯、茴香腦、己醛、2-己烯醛和3-異丁基-2-甲氧基吡嗪。茴香腦、(S)-3-乙基-4-甲基戊醇、苯酚、萘在研究的4種葡萄皮中含量遠高于果肉。

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