1株產(chǎn)聚-β-羥基丁酸芽胞桿菌的分離、篩選與鑒定

董夏夢,宋迤明,蔣冬花,藍(lán)麗精,蔡琪敏

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

聚-β-羥基丁酸(PHB)是微生物在營養(yǎng)不均衡條件下(如碳源過剩、氮、磷、硫等營養(yǎng)限制)積累在體內(nèi)作為其營養(yǎng)和能量儲(chǔ)存物質(zhì)的天然高分子儲(chǔ)存物(分子量50 000～1 000 000)。PHB首先由法國巴斯德研究所M.Lemoigne于1926年從巨大芽胞桿菌(Bacillus m egatherium)中分離鑒定,其在物理性質(zhì)甚至分子結(jié)構(gòu)上都與聚丙烯很相似,作為一種天然高分子聚合物,它還具有生物可降解性、生物相容性、低透氧性、無刺激性、光學(xué)活性等特殊性能[1]。作為無公害塑料,PHB吸引了廣泛的關(guān)注。目前國內(nèi)外所用PHB生產(chǎn)菌種中以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌研究及應(yīng)用最為廣泛[2]。真核生物中尚未發(fā)現(xiàn)有PHB顆粒存在[3],而原核生物中,革蘭陽性菌或陰性菌均發(fā)現(xiàn)PHB產(chǎn)生菌,例如:產(chǎn)堿桿菌屬、固氮菌屬、假單胞菌屬、生絲微菌屬、嗜鹽桿菌屬和甲基桿菌屬等[4]。本研究從土壤中分離篩選到1株產(chǎn)PHB較高的芽胞桿菌PX-95,根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征以及分子技術(shù)將其鑒定為蘇云金芽胞桿菌(B acillus thuringiensis)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 芽胞桿菌菌株分離篩選自浙江省各地(杭州、寧波、溫州、紹興、金華、臺(tái)州、麗水)采集的土樣,包括玉米地、番薯地、花生地等土壤。1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂20,pH 7～7.2,用于菌種分離;②種子培養(yǎng)基:牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,pH 7～7.2;③發(fā)酵培養(yǎng)基[5]:蔗糖10,牛肉膏5,MgSO4·7H2O 0.2,CaCl20.05,FeCl30.01,K2HPO40.04,KH2PO40.03,NaH2PO4·2H2O 0.05,H3BO30.005,pH 7.8。

1.1.3 主要試劑 聚-β-羥基丁酸(PHB)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司,蘇丹黑購自上海生工生物工程有限公司,其他試劑均為國產(chǎn)生化試劑或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 高產(chǎn)PHB芽胞桿菌的分離、篩選 ①芽胞桿菌的分離、純化:取土樣1.0 g,加9 mL無菌水稀釋,80℃水浴15 min后,進(jìn)行10-1～10-4梯度稀釋,取10-2濃度稀釋液100μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)24 h。挑取圓形乳白色單菌落,進(jìn)一步分離、純化后,獲得純菌株,編號(hào)保存;②PHB顆粒染色初篩產(chǎn)生PHB菌株:用蘇丹黑染色法。PHB顆粒呈黑綠色,菌體呈紅色。以PHB顆粒大小和生長速率作為標(biāo)準(zhǔn)初步篩選產(chǎn)生PHB菌株;③PHB初步定量測定復(fù)篩高產(chǎn)PHB菌株:挑取初篩獲得的純菌株單菌落接種于150 mL錐形瓶(含30 mL種子培養(yǎng)基)中,30℃,180 r/min培養(yǎng)12 h,用作發(fā)酵種子。按6%比例轉(zhuǎn)接于250 mL錐形瓶(含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基)中,按上述條件培養(yǎng)48 h用于PHB的定量分析。綜合比較,篩選高產(chǎn)PHB原始菌株。PHB的初步定量分析按Law和Slepecky法[6]進(jìn)行。經(jīng)培養(yǎng)、離心獲得的菌體細(xì)胞用氯仿60℃抽提1 h后,用濃硫酸100℃處理10 min,冷卻至室溫并混勻,用紫外分光光度計(jì)在235 nm波長下測定吸光值。

1.2.2 鑒定 ①形態(tài)特征及生理生化實(shí)驗(yàn):篩選獲得高產(chǎn)PHB菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上30℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行染色觀察,48 h后觀察菌落形態(tài);生理生化實(shí)驗(yàn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第9版進(jìn)行,綜合以上各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行初步鑒定;②16S rDNA的PCR擴(kuò)增、序列測定:用UN IQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌種的基因組DNA,利用16S rDNA通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序:98℃5 min,95℃35 s,55℃35 s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán);72℃4 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后連入克隆載體pMD18-T,并由上海生物工程技術(shù)有限公司完成測序。將所得基因序列在GenBank進(jìn)行Blast比對(duì);③gyrB基因的擴(kuò)增[7]:通過比較蠟樣芽胞桿菌和相近種的gyrB(DNA促旋酶B亞單位)基因序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段大小為365 bp的特異性引物:5′-ATTGGTGACACCGATCAAACA-3′,5′-TCAT ACGTATGGATGTTATTC-3′。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液2.5μL,dNTP混合液(dATP,dCTP,dGTP,dTTP濃度均為2.5 mmol/L)0.5μL,rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5μL,模板DNA 1μL,引物(20 μmol/L)各0.5μL,ddH2O補(bǔ)足體積至25μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃5 min,94℃30 s,56℃30 s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán);72℃5 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHB產(chǎn)生菌的分離、純化與篩選

通過分離、純化和初步鑒定,共獲得188株芽胞桿菌菌株。以鏡檢PHB顆粒的大小和生長速率作為初篩標(biāo)準(zhǔn),從中選出53株菌株(圖1),分別用牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基保藏,待后期進(jìn)行復(fù)篩。

圖1 代表性芽胞桿菌菌株菌體蘇丹黑染色結(jié)果Fig.1 Sudan black dyeing of typicalBacillusstrains

2.2 高產(chǎn)PHB菌株復(fù)篩

選出10株積累PHB相對(duì)較高的菌株,其中以PX-95菌株(分離自花生地土壤)的積累量最高,PHB產(chǎn)量為135.81 mg/L,結(jié)果見圖2。故對(duì)PX-95菌株進(jìn)行鑒定。PHB定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:

其中:X代表PHB的質(zhì)量濃度;Y代表吸光度,單位為μg/L。根據(jù)菌體中提取PHB的吸光度,計(jì)算菌體中PHB的含量并轉(zhuǎn)化為mg/L。

2.3 PX-95菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 PX-95菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48 h后,菌落扁平呈白色,無光澤,表面較粗糙。革蘭染色呈陽性,菌體桿狀,有芽胞,芽胞囊無明顯膨脹,菌體大小約為(1.1～1.2)μm×(3.2～5.5)μm;衣鞘薄而無色,有粘性,游離的單菌體常附在外邊,側(cè)生鞭毛,單菌能活躍運(yùn)動(dòng);異染顆粒有且較大,占菌體的1/3,菌體內(nèi)PHB顆粒較多,有的占菌體的3/4。菌落及菌體形態(tài)見圖3。

圖2 10株芽胞桿菌菌株菌體中PHB產(chǎn)量Fig.2 The PHB productions of 10 selectedBacillusin cell

圖3 PX-95菌株菌落和菌體形態(tài)特征Fig.3 The character ofmorphology and colony of strain PX-95

2.3.2 生理生化特征 PX-95菌株的生理生化特征和生長條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

表1 PX-95菌株的生理生化特征Table 1 Physiological properties of strain PX-95

表2 PX-95菌株的生長條件Table 2 culture conditions of strain PX-95

根據(jù)PX-95菌株的菌落特征、生理生化特性實(shí)驗(yàn)和生長條件實(shí)驗(yàn),參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第9版,初步鑒定PX-95菌株屬于芽胞桿菌屬蠟樣芽胞桿菌群。

2.3.3 16S r DNA基因序列 采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得一長度為1 398 bp的基因,序列測定由上海生物工程技術(shù)有限公司完成。將PX-95菌株16S r DNA基因序列通過Blast對(duì)比分析,菌株序列與蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌同源性都很高,蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌以及產(chǎn)氣夾膜梭狀芽胞桿菌的16S rDNA基因序列具有高度同源性,它們之間的序列差異一般只有0～9個(gè)堿基[8]。根據(jù)以上結(jié)果,建立芽胞桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。

圖4 基于16S rDNA基因序列建立的芽胞桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus based on 16S rDNA gene sequence

2.3.4 PCR擴(kuò)增gyrB基因鑒定 進(jìn)一步區(qū)分蠟樣芽胞桿菌與蘇云金芽胞桿菌可用PCR擴(kuò)增gyrB(DNA促旋酶B亞單位)基因。蠟樣芽胞桿菌能特異性擴(kuò)增出365 bpgyrB基因片段,而蘇云金芽胞桿菌則無特異性條帶。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明:該引物對(duì)蠟樣芽胞桿菌具有特異性,只有蠟樣芽胞桿菌能產(chǎn)生特異性條帶,其擴(kuò)增片段為365 bp,而蘇云金芽胞桿菌不出現(xiàn)特異性條帶,僅見引物二聚體。因此,將PX-95菌株確定為蘇云金芽胞桿菌(圖5)。

圖5 gyrB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR analysis of gyrB gene

3 討 論

PHB具有多種優(yōu)良特性,作為目前最具代表性的一類生物材料,PHB的開發(fā)及應(yīng)用逐步加大。隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng),其發(fā)展遠(yuǎn)景也得到了國際上的廣泛認(rèn)可,吸引了眾多科研工作者的關(guān)注,成為國際研究開發(fā)熱點(diǎn)[8]。目前國際上主要采用的方法是篩選獲得產(chǎn)PHB的菌株,并通過各種方法提高其產(chǎn)量。如尋找微生物能夠利用的廉價(jià)碳源和培養(yǎng)材料,應(yīng)用遺傳操作構(gòu)建基因工程菌,此外還有一些研究嘗試在植物體中合成PHB[9]。

目前國內(nèi)外芽胞桿菌屬合成PHB的相關(guān)研究相對(duì)較少:周琴等[10]篩選得到了1株產(chǎn)量0.763 g/L的巨大芽胞桿菌;呂早生等[11]提取、鑒定了蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)的聚羥基烷酸;郭秀君等[12]研究了蠟樣芽胞桿菌芽胞形成與PHB的關(guān)系。邵志會(huì)等[13]建立了蘇云金芽胞桿菌的代謝動(dòng)力學(xué)模型,成功地模擬了該菌株的生長、葡萄糖、聚-β-羥基丁酸(PHB)、吡啶二羧酸(DPA)和毒蛋白(ICPs)的變化過程,嚴(yán)瑾等[14]構(gòu)建了蘇云金芽胞桿菌工程菌株,考察了胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸對(duì)菌體生理的影響,結(jié)果表明PHB能增強(qiáng)菌體對(duì)逆境的耐受能力。Pinar Kaynar[15]從魚內(nèi)臟中篩選獲得了30株芽胞桿菌,其中巴氏芽胞桿菌P2中PHB占菌體干重20.58%,而緩慢芽胞桿菌P18菌體中PHB達(dá)到了菌體干重的23.38%。Valappil[16]報(bào)道了1株以葡萄糖為碳源,PHB含量占菌體干重38%的蠟樣芽胞桿菌SPV。

本文篩選獲得1株產(chǎn)聚-β-羥基丁酸較高的芽胞桿菌菌株,通過PCR擴(kuò)增(DNA促旋酶B亞單位)gyrB基因的方法將其鑒定為蘇云金芽胞桿菌,此PCR檢測方法能特異性擴(kuò)增出蠟樣芽胞桿菌,其擴(kuò)增片段大小為365 bp,而蘇云金芽胞桿菌則無特異性條帶,且與其他芽胞桿菌菌株均無交叉反應(yīng),因此,可以應(yīng)用于蘇云金芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌的區(qū)別鑒定。

該菌的16S rDNA基因序列已在GenBank上登錄,登錄號(hào)為JN182235,其積累PHB的能力較強(qiáng),可達(dá)菌體干重的40.2%。該菌的培養(yǎng)條件還需進(jìn)一步進(jìn)行各種因子的交互實(shí)驗(yàn),尤其是培養(yǎng)基的碳氮比,對(duì)菌株產(chǎn)PHB的能力有重大的影響,有望通過培養(yǎng)條件優(yōu)化,產(chǎn)量可以大幅度提高,是1株具有較好應(yīng)用前景的菌株。

[1] 楊宇,徐愛玲,張燕飛,等.生物合成材料聚-β-羥基丁酸(PHB)的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2006,10(4)S2:61-67.

[2] 王麗,清水浩.真養(yǎng)產(chǎn)堿菌由丁酸積累聚-β-羥基丁酸的研究[J].微生物學(xué)報(bào),1993,33(1):48-53.

[3] D.Byrom.Polymer synthesis by microorganis ms:technology andeconomics[J].Trends in Biotechnology,1987,5(9):246-250.

[4] 祁紅兵,曹國清.聚-β-羥基丁酸酯(PHB)的研究及應(yīng)用前景[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,18(1):121-124.

[5] 許旭萍,陳接鋒,李惠珍.Sphaerotilus natansFQ40合成聚-β-羥基丁酸(PHB)條件的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(9):23-26.

[6] J.H.Law,R.A.Slepecky.Assay of poly-beta-hydroxybutyric acid[J].Journal ofBacteriology,1961,82:33-36.

[7] 王振國,劉和平,劉金華,等.應(yīng)用PCR方法檢測蠟樣芽胞桿菌的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(6):671-673.

[8] H.Eilert,S.Alexander,G.Hans.Schlegel Relationship between the photoproduction of hydrogen and the accumulation of PHB in non-sulphur purple bacteria[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1993,39(1):87-93.

[9] 吳桂芳,沈忠耀.轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)生物可降解塑料的研究進(jìn)展[J].科技進(jìn)展,2002,22(2):5-10.

[10] 周琴,蔣冬花,楊葉,等.合成聚-β-羥基丁酸芽胞桿菌的篩選、鑒定及碳氮源優(yōu)化[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,33(2):203-209.

[11] 呂早生,張敏,李凌凌,等.蠟狀芽胞桿菌產(chǎn)聚羥基烷酸的提取與鑒定[J].化學(xué)與生物工程,2008,25(8):52-54.

[12] 郭秀君,鄭平,王薇,等.蠟質(zhì)芽胞桿菌芽胞的形成及與PHB的關(guān)系[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1994,29(1):101-108.

[13] 邵志會(huì),陳守文,徐建,等.蘇云金芽胞桿菌BM B005的代謝動(dòng)力學(xué)[J].工業(yè)微生物,2005,35(1):1-5.

[14] 嚴(yán)瑾,陳德局,陳守文,等.胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸酯對(duì)蘇云金芽胞桿菌營養(yǎng)細(xì)胞耐受性的影響[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,7(2):58-62.

[15] K.Pinar,B.Yavuz.Determination of poly-β-hydroxybutyrate production byBacillusspp.isolated from the intestines of various fishes[J].Chemistry and Biochemistry,2009,75(2):439-443.

[16] S.P.Valappil,S.K.Misra,A.R.Boccaccini,et al.Largescale production and efficient recovery of PHB with desirable materialproperties,from the newly characterized Bacillus cereus SPV[J].Journal of Biotechnology,2007,132(3):251-258.