太子參中環(huán)肽Pseudostellarin A的超聲提取工藝研究

吳 兵，陳 新，何 超，寇蕓蕓，周 艷

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

太子參系常用中藥，它為石竹科(Caryophyllaceae)異葉假繁縷屬植物Pseudostellaria Heterophylla(Miq.)Pax的干燥塊根，別名孩兒參、童參。全國各地均有分布，主產(chǎn)于福建、山東、安徽、江蘇等省。具益氣健脾、生浸潤肺之功。用于治療脾虛體倦，食欲不振，神經(jīng)衰弱和小兒病后體力恢復(fù)，為補(bǔ)氣藥中的一味清補(bǔ)之品［1］。與人參功用相仿，但以“清補(bǔ)”見長，特點(diǎn)為益氣但不升提，生津但不助濕，扶正卻不戀邪，補(bǔ)虛又不均猛。主治心悸自汗，疲倦乏力，脾虛食少，氣陰不足，自汗口渴，肺燥干咳等癥。環(huán)肽作為一類重要的化合物，在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等許多方面有著可觀的發(fā)展前景。太子參中的環(huán)肽成分具酪氨酸酶抑制活性［2-4］。國內(nèi)外對太子參環(huán)肽Pseudostellarin A的研究集中在提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定上［2-4］，對太子參中環(huán)肽Pseudostellarin A的含量分析和提取工藝研究尚未見報(bào)道。本文以本實(shí)驗(yàn)室分離、純化所得的Pseudostellarin A(純度為98%以上)為對照品，進(jìn)行太子參Pseudostellarin A的含量測定和分析檢測方法研究，在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)進(jìn)行太子參Pseudostellarin A的提取工藝研究，為太子參環(huán)肽的進(jìn)一步開發(fā)，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

DIONEX高效液相色譜儀(備有單元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器以及UVD170U檢測器)：美國戴安公司;SB-5200雙頻超聲清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司;BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;瑞士BUCHI公司;GRACE固相萃取儀;予華SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器廠。

1.2 試驗(yàn)材料

Pseudostellarin A對照品(本實(shí)驗(yàn)室分離純化所得，經(jīng)液相 HPLC檢測，純度 ＞98%)，乙腈(色譜純，科密歐公司)，試驗(yàn)用水為Aquapro超純水，其他試劑為分析純。太子參產(chǎn)于福建，購于武漢市同濟(jì)堂藥店。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 太子參環(huán)肽提取工藝

提取工藝見圖1。

圖1 太子參環(huán)肽提取工藝流程示意圖

1.3.2 太子參環(huán)肽測定方法

取100 mg太子參環(huán)肽制品定容至100 mL，并從中精密吸取10 mL至10 mL的容量瓶中，HPLC法測定太子參環(huán)肽的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 色譜條件

色譜柱為 GRACE C18(250×4.6mm)，流動(dòng)相為乙腈：1‰THF水溶液(25∶75)，紫外檢測波長為203nm，柱溫25℃，流速為1mL·min-1，檢測時(shí)間為0-15min。

2.1.2 線性關(guān)系考察

精密稱取Pseudostellarin A對照品3.1mg，用色譜甲醇定容到10mL的容量瓶中。依次取5mL，2.5 mL，1.25mL，0.625mL，0.3125mL 的對照品溶液用色譜甲醇定容到10mL的容量瓶中，配制出310 μg/mL，155 μg/mL，77.5 μg/mL，38.75 μg/mL，19.375 μg/mL，9.688μg/mL 對照品溶液。根據(jù) Pseudostellarin A的濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，在 9.688 μg/mL—310 μg/mL，Y=0.8676X+0.1729 范圍內(nèi)峰面積 Y與濃度X的線性關(guān)系良好，γ=0.9999(Y=0.8676X+0.1729)。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 太子參Pseudostellarin A標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取時(shí)間對太子參環(huán)肽含量的影響

將實(shí)驗(yàn)溫度恒定為30℃，料液比為1∶10，超聲提取時(shí)間為1.5h，乙醇濃度為100%，并以此提取條件為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。在此基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)條件下，選擇0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對環(huán)肽A含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，超聲提取時(shí)間為1h，1.5 h，2 h時(shí)，提取液中環(huán)肽含量較大。環(huán)肽的含量開始隨著提取時(shí)間的增長而逐漸增大，但當(dāng)時(shí)間增大到2h時(shí)，環(huán)肽含量達(dá)到最大，隨后卻開始降低。

2.3 乙醇濃度對太子參環(huán)肽含量的影響

在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)條件下，選定 20%，50%，70%，90%，100%的乙醇溶液進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對環(huán)肽A含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在其他條件不變的條件下，在乙醇濃度為70%，90%，100%時(shí)，太子參環(huán)肽含量較高。太子參環(huán)肽含量在低濃度的乙醇提取液中含量不是很高，在高濃度的乙醇提取液中含量增加。

2.4 料液比對太子參環(huán)肽含量的影響

在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)條件下，選定料液‘1∶2，1∶5，1∶7，1∶12，1∶15 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對環(huán)肽含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在其他條件不變時(shí)，在料液比為1∶7，1∶12時(shí)，環(huán)肽A的含量較大。剛開始環(huán)肽A的含量隨著料液比的增加而增加，隨后隨著料液比的增大，環(huán)肽A的含量增加的趨勢開始變得不明顯。環(huán)肽A含量在開始會隨著提取溶劑的增多而增加，而當(dāng)浸提完全后，再增加溶劑的比例影響不顯著。

2.5 太子參環(huán)肽A最佳提取工藝的確定

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選定超聲提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度三因素為考察指標(biāo)，按L9(34)正交表三因素三水平實(shí)驗(yàn)，從中篩選最佳的工藝條件和技術(shù)參數(shù)，結(jié)果分別見表1和表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2可知，影響影響Pseudostellarin A濃度大小的因素顯著性順序依次為C＞A＞B，即乙醇濃度＞超聲時(shí)間＞料液比。最優(yōu)方案為A2B3C3，即在溫度為30℃，超聲時(shí)間1小時(shí)，料液比1∶15，乙醇濃度為100%時(shí)，太子參Pseudostellarin A的提取濃度最高，測得環(huán)肽A的濃度為4.8μg/g。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果見方差分析表3。

表3 方差分析表

正交試驗(yàn)結(jié)果表明乙醇濃度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響顯著，且影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性依次為乙醇濃度＞超聲時(shí)間＞料液比。優(yōu)化后的提取工藝為A2B3C3，即在溫度為30℃，超聲時(shí)間1小時(shí)，料液比1∶15，乙醇濃度為100%。在此條件下，太子參環(huán)肽A的提取濃度最大為 4.8 μg/g。

3 結(jié)論

目前國內(nèi)外尚未報(bào)道太子參環(huán)肽Pseudostellarin A的含量測定及分析檢測方法相關(guān)的研究，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，對太子參建立了環(huán)肽Pseudostellarin A的分析檢測方法，在此基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)得出在溫度為30℃，超聲時(shí)間1h，料液比1∶15，乙醇濃度為100%時(shí)，為太子參Pseudostellarin A的提取濃度最高為4.8 μg/g。本實(shí)驗(yàn)研究不僅建立了Pseudostellarin A的含量測定及分析檢測方法，而且進(jìn)行了太子參環(huán)肽Pseudostellarin A提取工藝研究，為今后Pseudostellarin A進(jìn)一步的研究奠定了工作基礎(chǔ)。

［1］ 李仕海，劉訓(xùn)紅.江蘇地產(chǎn)太子參中氨基酸及微量元素的分析［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2001，12(3)：199-200.

［2］ Hiroshi Morita，Takashi Kayashita，Hideyuki Kobata，et al.Pseudoste-llarins A-C，new tyrosinase inhibitory cyclic peptides from Pseudostellaria Heterophylla［J］.Tetrahedron，1994，50(23)：6797-6804.

［3］ Hiroshi Morita，Takashi Kayashita，Hideyuki Kobata，et al.Pseudostella-rins D-F，new tyrosinase inhibitory cyclic peptides from Pseudostellaria Heterophylla［J］.Tetrahedron，1994，50(33)：9975-9982.

［4］ Hiroshi Morita，Takashi Kayashita，Hideyuki Kobata，et al.Pseudostell-arins A，new tyrosinase inhibitorycyclic peptides from Pseudostellaria Heterophylla［J］.Tetrahedron Letters，1994，35(21)：3563-3564.