大腸桿菌L-組氨酸生物合成途徑的改造及其對工程菌L-組氨酸產量的影響

魏 偉，劉 倩，盧利寧，謝希賢

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

大腸桿菌L-組氨酸生物合成途徑的改造及其對工程菌L-組氨酸產量的影響

魏 偉，劉 倩，盧利寧，謝希賢

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

改造大腸桿菌L–組氨酸生物合成途徑，以提高L–組氨酸的產量.用NTG誘變大腸桿菌M-17(SGr)，依次賦予其 2–噻唑丙氨酸(2-TA)和組氨酸氧肟酸鹽(HisHx)遺傳標記，再以突變株 M-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)基因組為模板，擴增組氨酸操縱子基因，構建出重組質粒pUC118-his-operon，將重組質粒導入突變株M-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)得到工程菌E. coli M-19(SGr＋2-TAr＋HisHxr/pUC118-his-operon).根據zwf和prs基因序列分別合成引物進行PCR擴增，PCR產物與載體pSTV28連接，構建重組質粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs，將重組質粒分別轉化至工程菌E. coli M-19，搖瓶發(fā)酵測定重組工程菌L–組氨酸的產量.搖瓶發(fā)酵結果顯示，L–組氨酸產量與對照株相比，工程菌E. coli M-19提高了4.5倍，雙質粒系統(tǒng)重組工程菌E. coli MZH-19、E. coli MPH-19和E. coli MZPH-19分別提高了5.14、5.78、8.43倍.

L–組氨酸；組氨酸操縱子；大腸桿菌；雙質粒系統(tǒng)；搖瓶發(fā)酵

L–組氨酸的化學名為 L–α–氨基–β–咪唑丙酸，是含有咪唑核的堿性氨基酸，具有多種生理功能，在醫(yī)藥、飼料及食品行業(yè)發(fā)揮著重要的作用[1].目前，國內對發(fā)酵生產組氨酸的研究和報道較少，且產酸水平較低.其中姚曉玲等[2]利用黃色短桿菌發(fā)酵可積累 L–組氨酸 128.28,mg/L，許益清等[3]以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，定向選育突變株，發(fā)酵 3,d產 L–組氨酸達1～1.6,g/L.但這遠遠不能滿足市場需求，因此加快研究發(fā)酵生產L–組氨酸的意義重大.

本文通過亞硝基胍(NTG)誘變選育具有組氨酸結構類似物抗性的突變株，解除 L–組氨酸對生物合成途徑上的關鍵酶[4]——ATP磷酸核糖基轉移酶(ATP-PRT，hisG 基因編碼)的反饋抑制.利用雙質粒系統(tǒng)對 L–組氨酸生物合成途徑進行改造，過表達整個組氨酸操縱子和中心代謝途徑的zwf和prs基因，增加大腸桿菌 L–組氨酸生物合成的代謝流，以期進一步提高 L–組氨酸產量，并為構建高產 L–組氨酸工程菌奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

1.1.1 菌株及質粒

E. coli DH5α及 E. coli M-17(SGr)均為天津科技大學代謝工程實驗室保藏菌種；質粒 pUC118、pSTV28，TaKaRa公司.

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L)

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl,10，pH,7.0，抗生素氨芐青霉素使用質量濃度為 100μg/mL，氯霉素使用質量濃度為25,μg/mL.

基本培養(yǎng)基：葡萄糖 5，硫酸銨 10，磷酸二氫鉀1.0，硫酸鎂 0.4，硫酸錳 0.01，硫酸亞鐵 0.01，VB1,100,μg，VH,100,μg，瓊脂粉 20，pH,7.0～7.2.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 15，硫酸銨 3，玉米漿10,mL，磷酸二氫鉀 1.0，硫酸鎂 0.4，硫酸錳 0.01，硫酸亞鐵 0.01，VB1300,μg，VH200,μg，pH,7.0～7.2.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20，硫酸銨 10，玉米漿20,mL，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.015，硫酸亞鐵 0.015，VB1,200,μg，VH,100,μg，pH,7.0～7.2.

1.2 試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶，TaKaRa 公司；Long PCR Enzyme Mix、1 000 bp ladder，Fermentas公司；PCR引物由北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成；PCR產物純化試劑盒，北京天恩澤基因科技有限公司；質粒小樣快速提取試劑盒和細菌基因組提取試劑盒，北京博邁德公司；IPTG、X-gal、氨芐青霉素、氯霉素，北京索萊寶公司；誘變劑亞硝基胍(NTG)，日本 TCI公司；L–組氨酸(L-His)、2–噻唑丙氨酸(2-TA)及組氨酸氧肟酸鹽(HisHx)，美國Sigma公司；其余試劑均為國產分析純.

1.3 方法

1.3.1 誘變方法

常規(guī)化學誘變法，參見文獻[5].

1.3.2 目的突變株的篩選

結構類似物突變株的獲得：將誘變處理的菌液適度稀釋后涂布于含有一定濃度的 2-TA和 HisHx的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 2～3,d，挑出單菌落，即得到結構類似物2-TA和HisHx抗性突變株.

1.3.3 PCR引物設計與合成

根據 GenBank中 E. coli K-12編碼 his operon(7,461,bp)、zwf(1,476 bp)和 prs(948,bp)基因序列，分別設計引物，在兩端引入酶切位點(下劃線所示)和保護堿基.分別用引物 H1(CTCGTCGGATCC TCCTTTCCCCGCTCATTCATT)/H2(TGTTCGGGA TCC AAGAAAAAGGGCAGGGTGGTG)、Z1(GCAA GGATCC ACTTAAGGAGAATGACATGGCGGT)/Z2(TGAGCGCATGCCGCAGATATTACTCAAACTCA T)和P1(GCTAGAATTC CCTGAGGTTCTTCTCGT GCCTGATA)/P2(AGCCGGATCCTTAGTGTTCGAA CATGGCAGAGATC)來擴增突變株 E.,coliM-18(SGr+2-TAr+HisHxr)的 his operon、zwf和prs基因及其上下游部分序列，其中長片段his operon基因PCR擴增反應體系總體積為 50,μL，反應條件為：94,℃,2,min，94,℃,20,s，55,℃,30,s，68,℃,6,min，共 25 個循環(huán)；68,℃,10,min.DNA片段的回收、酶切、純化、與載體的連接、轉化等操作參見文獻[6].

1.3.4 his operon、zwf和prs基因的克隆與測序

取PCR產物5,μL在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，使用 DNA凝膠回收試劑盒回收，回收產物直接與 pMD19-T Simple載體連接，連接產物轉化E.,coliDH5α,感受態(tài)，在含 IPTG(24,mg/mL)和 X-gal(20,mg/mL)的 Ampr(100,μg/mL)的 LB 平板上 37,℃培養(yǎng)16,h，隨機挑選白色菌落進行PCR；并提取質粒單酶切驗證，得到重組質粒 pMD19-his-operon、pMD19-zwf和pMD19-prs，進行測序和序列分析.

1.3.5 重組質粒的構建

用限制性內切酶BamHI酶切重組質粒 pMD19-his-operon，純化回收后，與 pUC118BamHI/BAP載體按等物質的量比連接轉化，電轉化法轉化E.,coliDH5α感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選轉化子，挑選單克隆，提取質粒，酶切鑒定.用限制性內切酶BamHI和SphI對重組質粒 pMD19-zwf及質粒pSTV28雙酶切，用限制性內切酶EcoRI和BamHI對重組質粒 pMD19-prs及質粒 pSTV28雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，按照質粒 DNA與目的基因物質的量比為 1∶4進行連接轉化，化學法轉化E.,coli DH5α感受態(tài)細胞，在氯霉素抗性平板上篩選轉化子，隨機挑取單菌落進行菌落PCR驗證，并提質粒進行雙酶切驗證.

1.3.6 搖瓶發(fā)酵

種子培養(yǎng)：500,mL擋板瓶中裝液量為30,mL，9層紗布封口，往復式搖床200,r/min、32,℃培養(yǎng)12～15,h.

搖瓶發(fā)酵：按10%的接種量將種子液接入裝液量為27,mL的500,mL擋板瓶中，搖床200,r/min、32,℃培養(yǎng) 36,h.發(fā)酵期間補加氨水控制 pH在 7.0左右，流加60%葡萄糖，使其維持在1%～2%.

1.3.7 分析方法

采用高效液相分析系統(tǒng)測定L–組氨酸含量[7].

2 結果與分析

2.1 組氨酸結構類似物的抗性突變株的篩選

利用NTG對出發(fā)菌株E. coli M-17(SGr)進行誘變處理，將其涂布到含有 2-TA(3,g/L)的基本培養(yǎng)基上，篩選到11株能積累 L–組氨酸的突變株，在這 11株菌中選活力較高的突變株 E.,coli M-17(SGr＋2-TAr)為再次誘變的出發(fā)菌株.在野生菌體內，當L–組氨酸含量達到生理需要時，L–組氨酸操縱子受到終產物L–組氨酸的反饋阻遏.另外，合成途徑的第1個酶ATP-PRT是L–組氨酸合成途徑的限速酶，酶活性受到終產物 L–組氨酸的反饋抑制[4].通過賦予組氨酸結構類似物抗性標記可以解除 L–組氨酸對 ATPPRT的反饋抑制[8].對突變株E. coli MTA-17(SGr+2-TAr)再次誘變，同樣方法篩選得到 HisHx(10 g/L)的抗性突變株E. coli M-18(SGr+2-TAr+ HisHxr)，但是該突變株的組氨酸產量沒有明顯的提高.

2.2 his operon、zwf和prs基因的PCR擴增

以提取的突變株 M-18的基因組為模板，H1/H2、Z1/Z2和 P1/P2為引物分別擴增部分脫敏的his operon、zwf和prs基因，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖 1所示.在約 7,500、1,500、1,000,bp處有目的條帶，與預期大小相符.

圖1 PCR擴增結果Fig.1 Results of PCR amplification

2.3 重組質粒的構建及其酶切驗證

按方法 1.3.5構建重組質粒，并對陽性克隆進行限制性酶切分析，結果如圖 2所示.重組質粒pUC118-his-operon、pSTV28-zwf、pSTV28-prs 和pSTV28-zwf-prs雙酶切后與預期大小相符，表明重組質粒構建成功.

圖2 重組質粒的酶切驗證Fig.2 Identification of recombinant plasmids by digestion

將重組質粒 pUC118-his-operon、pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs分別轉化至突變株E.coli M-18，得到重組工程菌 M-19(SGr+,2-TAr+His Hxr/pUC118-his-operon)、MZH-19(SGr+,2-TAr+HisHxr/pSTV28-zwf/pUC118-his-operon)、MPH-19(SGr+2-TAr+HisHxr/pSTV28-prs/pUC118-his-operon和MZPH-19(SGr+2-TAr+HisHxr/pSTV28-zwf-prs/pUC118-hisoperon).

2.4 工程菌的搖瓶發(fā)酵

將重組工程菌 E.,coli M-19、E. coli MZH-19、E.coli MPH-19、E.,coli MZPH-19和對照株E.,coli M-18進行搖瓶發(fā)酵36,h，測定L-組氨酸產量，結果如圖3所示.

圖3 不同菌株的L-組氨酸搖瓶發(fā)酵36 h產量的比較Fig.3 Production of 36 h flask-shaking fermentation of L-histidine

由圖3可知，工程菌E. coli M-19、E. coli MZH-19、E. coli MPH-19、E. coli MZPH-19 的 L–組氨酸產量與對照株相比，分別提高了 4.5、5.14、5.78、8.43倍.工程菌 E. coli M-19中重組質粒攜帶了脫敏的his operon基因，L–組氨酸產量提高，推測其原因為提高了其在大腸桿菌內的拷貝數及其所編碼酶的活性.zwf基因編碼的 G-6-PDH是 HMP途徑的限速酶，工程菌E. coli MZH-19在過表達his operon的同時又過表達了 zwf基因，使得 L–組氨酸產量提高，推測其原因為工程菌E. coli MZH-19的HMP途徑相對活躍，且 G-6-PDH催化產生了大量的 NADPH和H+，為生物體的合成提供還原力，同時也為L–組氨酸的合成提供了氫供體.工程菌E. coli MPH-19共表達了his operon和prs基因，使得L–組氨酸產量提高，推測其原因為 prs基因的過表達為 L–組氨酸的合成提供了更多的前體物質PRPP.工程菌E. coli MZPH-19表達了his operon和zwf-prs，使得L–組氨酸產量提高，推測其原因為 L–組氨酸合成的中心代謝途徑——HMP途徑增強，前體物質PRPP增多，葡萄糖的整個代謝流向合成L–組氨酸的方向分布.

3 結 語

L–組氨酸的合成代謝途徑較長，調控相對復雜，因此通過誘變單一地選育結構類似物抗性突變株并不會完全打通菌體內合成 L–組氨酸的代謝途徑，進而大量積累組氨酸.本研究通過傳統(tǒng)的誘變方法和基因工程相結合的手段來構建 L–組氨酸基因工程菌，對大腸桿菌 L–組氨酸生物合成的代謝途徑進行了改造.首先用亞硝基胍(NTG)誘變 E.,coli M-17(SGr)，依次賦予其2-TA和HisHx遺傳標記，得到突變株 E.,coli M-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)，再以提取的突變株E.,coli M-18基因組為模板，利用PCR技術擴增突變株的整個組氨酸操縱子基因，并將其連接到pUC118載體上，過表達組氨酸生物合成途徑上的一系列酶系，從而使組氨酸得到積累.由于重組質粒pUC118-his-operon在 11,000,bp左右，不易再進行分子生物學操作，故選擇了另一個可以相容的質粒pSTV28進行進一步的改造，且 pSTV28質粒的拷貝數較低，更有利于代謝物的生成.本研究利用了復制子不同的兩個相容性質粒 pSTV28(復制子為 p15A)和 pUC118(復制子為 pMB1)對 L–組氨酸生物合成途徑進行了進一步的改造，擴增了 L–組氨酸生物合成中心代謝途徑的關鍵酶編碼基因 zwf和編碼合成L–組氨酸的前體物質PRPP的prs基因.由實驗結果表明，雙質粒重組基因工程菌E. coli MZH-19、E.,coli MPH-19和 E.,coli MZPH-19與對照株比較，L–組氨酸產量分別提高了5.14、5.78、8.43倍，因此雙質粒系統(tǒng)的改造可進一步提高L–組氨酸的產量.

［1］陳寧. 氨基酸工藝學[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，2009.

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Modification of L-histidine Biosynthesis Pathway inE. coliand Its Effect on L-histidine Yield

WEI Wei，LIU Qian，LU Li-ning，XIE Xi-xian
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

To modify the metabolic pathway of L-histidine biosynthesis inE. coliand increase L-histidine yield. E. coli M-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)was obtained by N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)mutagenesis derived from the original strainE. coliM-17(SGr). The histidine operon was amplified by PCR fromE. coliM-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)chromosome and ligated it into the pUC118 vector. The recombinant plasmid pUC118-his-operon was transformed intoE. coliM-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)by electroporation. Thezwfgene and prs gene were amplified by PCR，and then ligated to pSTV28 plasmid. The recombinant plasmids pSTV28-zwf，pSTV28-prs and pSTV28-zwf-prswere transformed intoE. coliM-19(SGr＋2-TAr＋HisHxr/pUC118-his-operon)，respectively. Flask-shaking fermentation results showed that，compared withE. coliM-18，the L-histidine yield in the engineering strainE. coliM-19 was 4.5 folds of that in the control，and in the two-plasmid system of recombinant engineering strainsE. coliMZH-19，E. coliMPH-19 andE. coliMZPH-19 were 5.14 folds，5.78 folds and 8.43 folds of that in the control，respectively.

L-histidine；his operon；Escherichia coli；two-plasmid system；flask-shaking fermentation

Q812

A

1672-6510(2011)04-0006-04

2010–12–09；

2011–03–01

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2008BAI63B01)

魏 偉（1985—），男，山西長治人，碩士研究生；通信作者：謝希賢，副教授，xixianxie@tust.edu.cn.