諾氟沙星2種不同給藥方式在中國對蝦體內(nèi)的殘留及消除規(guī)律*

孫 銘,李 健,張 喆,王靜鳳

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島266003;2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室,山東青島266071)

諾氟沙星(No rfloxacin,NFLX)是氟喹諾酮類藥物之一,具有抗菌譜廣,抗菌力強,無交叉耐藥性[1-2]等特點。在水產(chǎn)上主要應用于魚、蝦、蟹、鱉等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的弧菌、嗜水氣單胞菌、柱狀桿菌、愛德華氏菌等引起的出血、爛鰓、腸炎、腹水、敗血等細菌疾病[3]。何平等研究了諾氟沙星在淡水青蝦體內(nèi)的藥代動力學特征[4];陳文銀研究了諾氟沙星在中華鱉體內(nèi)的藥代動力學[5];張雅斌等研究了諾氟沙星不同給藥方式下的在鯉魚中的藥代特征[6];房文紅研究了諾氟沙星在斑節(jié)對蝦血淋巴中的藥代特征[7]及2種給藥方式下諾氟沙星在凡納濱對蝦體內(nèi)的轉運和消除規(guī)律[8]。諾氟沙星在人類疾病防治上也被臨床廣泛應用,成為治療感染性疾病的重要藥物。但此類藥物在食品動物中的殘留會引起人類病原菌對其產(chǎn)生耐藥性,它產(chǎn)生的毒副作用還會對人體產(chǎn)生直接的危害,如對肝代謝有干擾作用,而且還破壞和減少體內(nèi)紅細胞、白細胞的數(shù)目,因而其在可食性動物組織中的殘留問題已經(jīng)日益引起人們的關注。目前,有關NFLX在中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)體內(nèi)的殘留研究國內(nèi)外尚未見報道,并且同一種藥物在不同給藥方式下其殘留特征也有所差別。本實驗模擬實際養(yǎng)殖條件,研究了藥浴給藥和藥餌給藥2種方式下NFLX在中國對蝦組織中的殘留及消除狀況,為制定合理的休藥期以及臨床用藥提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康中國對蝦,平均體質量(17.34±1.00)g,平均體長(11.81±0.60)cm,購于膠州寶榮水產(chǎn)科技有限公司。試驗前暫養(yǎng)2周,投喂不含任何藥物的配合飼料,海水取自寶榮水產(chǎn)科技有限公司養(yǎng)殖用水,水溫(28±1)℃,鹽度為18,連續(xù)充氧。1.1.2藥品和試劑 諾氟沙星標準品(99.5%),諾氟沙星原粉(純度為94.78%),乙腈和甲醇色譜純,磷酸,三乙胺,正己烷,均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線及檢測限 將配置的濃度為0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2和5μg/m L諾氟沙星標準溶液,依次從低濃度到高濃度進行HPLC(Agilent-1100型)測定。用熒光檢測器檢測,記錄其峰面積。以諾氟沙星濃度為橫坐標(x),峰面積為縱坐標(y)做標準曲線。進行回歸分析,求出回歸方程和相關系數(shù)及曲線估計標準誤差。

最低檢測限的確定根據(jù)公式LOD=3×V×C/(S/N)計算的。其中V-進樣體積(m L);C-最小檢測濃度(μg/m L);S/N-信噪比。

1.2.2 回收率及精密度 回收率:一組取0.1、0.5、1、5μg/m L 4個水平的諾氟沙星標準液濃度各1 m L,分別加入1 g肌肉、肝胰臟、鰓和1 m L血淋巴4種空白組織中,每個濃度有3個平行,處理樣品后進行HPLC測定;另一組為標準溶液經(jīng)處理后進行HPLC測定。按照公式計算回收率。回收率=(處理前加入標準液樣品的測定值/標準溶液的測定值)×100%。

精密度:取0.1、0.5、1、5μg/m L不同濃度諾氟沙星標準液,分別加入4種組織中,經(jīng)處理后,制得的各濃度樣品于1 d內(nèi)分別重復進樣5次和連續(xù)進樣5d測定,計算各濃度水平響應值峰面積的變異系數(shù)C.V。

1.2.3 給藥及取樣 健康中國對蝦360尾,隨機分在36個200 L的桶里,藥浴和藥餌各18桶,每桶10尾,連續(xù)充氣,暫養(yǎng)2周后用于實驗。藥餌給藥:30 mg/kg·bw藥餌連續(xù)投喂5 d,每天投喂4次;5 d后投喂空白餌料;藥浴給藥:10 mg/L藥浴5 d。給藥期間不換水,分別在0.5、2、4、6、9、12、24、48、96、144、216、288、384 h取血、肌肉、肝胰腺、鰓組織,每一個時間點隨機取6尾蝦用于藥物分析。另取未給藥的中國對蝦作空白對照。全部樣品-20℃冷凍保存用于藥物分析。

1.2.4 樣品的處理 準確稱取1 g組織,置于50 m L離心管中,加入2 m L乙腈,用高速分散器勻散,再用2 m L乙腈清洗刀頭,合并2次提取液,于振蕩器上振蕩30 s,靜置2 h,然后5 000 r/min離心10 min,吸取全部上清液;在40℃恒溫水浴下氮氣吹干,殘留物用1 m L流動相溶解,加入2 mL正己烷去脂肪,下層過0.22μm濾膜,過濾后的液體進行高效液相色譜測定。

1.2.5 測定條件 柱子條件:Agilent TC-C18(5μm,250×4.6 mm,I.D);流動相:乙腈:0.01 mol/L的磷酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)至p H 3.42)=16∶84(L/L);流速,1.0 mL/min;熒光檢測器,激發(fā)波長280 nm,發(fā)射波長450 nm;柱溫,30℃;手動進樣量,20μL。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 將濃度-時間數(shù)據(jù)用計算機擬合,求出消除速率常數(shù)(β)和消除曲線方程;采用公式t1/2=0.693/β計算消除半衰期(t1/2);根據(jù)消除曲線方程計算理論休藥期。

NFXL是按一級動力學過程從體內(nèi)消除的,即在消除后期服從指數(shù)消除:Ci=C0e-kt,可以根據(jù)消除后期測定的組織藥物濃度及規(guī)定的最高殘留限量(M RL),計算各組織藥物濃度降至規(guī)定水平所需時間:

2 結果

2.1 標準曲線及檢測限

標準溶液在0.01～5μg/m L濃度范圍內(nèi)具有良好的相關性,線性回歸方程y=908.26 x+15.67,R2=0.9999。本方法的最低檢測限為0.01μg/m L。

圖1 熒光檢測器所檢測的峰面積與NFLX濃度的關系Fig.1 Relationship between peak area detected by FLD detector and norfloxacin concentrations

2.2 回收率(見表1)

表1 諾氟沙星在肝胰腺、肌肉、血淋巴、鰓4種組織中的回收率Table 1 Recovery of Nor floxacin in hepatopancreas,musle,plasma,gill of Fennerropenaeus chinensis

2.3 精密度

按照精密度測定方法操作,測得4種組織中0.01,0.05,1和5μg·m L-14個濃度水平的日內(nèi)精密度為(2.37±1.21)%～(3.78±1.25)%,日間精密度為(3.46±1.51)%～(4.08±1.63)%。

2.4 2種給藥方式下諾氟沙星在組織中的分布及殘留

2種給藥方式下,藥物在血淋巴和各組織中的分布如圖2a～d,可以看出藥物在血淋巴和肝臟、肌肉、鰓組織中的分布較廣泛,但在同時間點里,肝臟中的藥物濃度顯著高于其他組織。給藥后48 h除肝臟外,其他組織檢出微量殘留或未檢出殘留,給藥144 h后各組織均未檢測到藥物。

2.4.1 諾氟沙星在鰓中的分布及殘留 圖2b中可以看出,藥浴給藥方式下,鰓中藥物濃度在4 h達到藥峰0.129μg·g-1,6 h后開始下降,在48 h消除到0;給藥384 h后各組織均未檢測到藥物;而藥餌給藥方式下,鰓中藥物濃度在2 h達到高峰0.028μg·g-1,隨后開始下降,12 h后幾乎檢測不出。

2.4.2 諾氟沙星在血淋巴中的分布及殘留 圖2c中可以看出,藥浴給藥方式下,血淋巴中諾氟沙星表現(xiàn)為2個藥峰,分別在4和24h,藥物濃度分別為0.21和0.075μg·m L-1;而藥餌給藥方式下,血淋巴中諾氟沙星也分別在4和24 h表現(xiàn)出2個藥峰,藥物濃度分別為0.11和0.06μg·m L-1。從給藥后血藥濃度-時間變化曲線來看,在2種給藥方式下,中國對蝦血藥濃度的變化趨勢基本一致。但是,諾氟沙星藥浴給藥比藥餌給藥吸收程度好。

2.4.3 諾氟沙星在肝胰腺中的分布及殘留 圖2d可以看出,藥浴給藥下,肝胰腺中藥物濃度在9 h到達藥峰,濃度為1.361μg·g-1,12 h后迅速下降;而藥餌給藥下,肝胰腺藥物濃度首先呈上升趨勢,4 h就到達藥峰為0.744μg·g-1,在隨后幾個小時肝胰腺中濃度相差不大,24 h開始下降。

圖2 中國對蝦藥餌給藥(30 mg·kg-1)和藥浴給藥(10 mg·L-1)諾氟沙星后各組織的濃度-時間關系曲線Fig.2 Concentration of norfloxacin in four tissues of Fenneropenaeus chinensis following oral administration(30 mg·kg-1)and water administration(10 mg·L-1)

2.5 2種給藥方式下諾氟沙星在中國對蝦體內(nèi)的消除

給藥9 h后,藥浴給藥肌肉中諾氟沙星濃度高于藥餌給藥,但隨后各采樣點肌肉中諾氟沙星濃度均低于水產(chǎn)品諾氟沙星的殘留限量50μg·kg-1。但肝胰腺和鰓中諾氟沙星在不同給藥方式下相差較大。藥浴給藥下,鰓和肝胰腺中藥物濃度明顯高于藥餌給藥下鰓和肝胰腺中藥物濃度,且藥浴給藥下肝胰腺中藥物濃度達峰時間滯后5 h。

中國對蝦經(jīng)2種給藥方式給藥后,數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理得到血淋巴和肝胰腺、肌肉中藥物濃度(C)與時間(t)的關系的消除曲線方程、相關指數(shù)(r2)及消除半衰期(T1/2)見表2。

表2 中國對蝦藥浴給藥和藥餌給藥后3種組織中諾氟沙星消除方程及消除參數(shù)Table 2 Elimination equation and parameters of norfloxacin in three tissues of Fenneropenaeus chinensis following oral administration and water administration

3 討論

3.1 2種給藥方式下諾氟沙星在中國對蝦體內(nèi)的轉運途徑

藥餌給藥方式下,對蝦肝胰臟中的藥物濃度在4 h時較高可能是諾氟沙星在中國對蝦體內(nèi)的“首過效應”,房文紅、劉玉林等對此也有相關的報道[8-9]。對高等動物而言,口服給藥時藥物主要先通過胃腸黏膜及毛細血管,然后首先進入肝門靜脈,通過肝臟后才能進入血液循環(huán)[10]。4 h達到最高濃度后,藥物濃度開始下降,到9 h又達到1個峰值,即肝臟中出現(xiàn)了藥物重吸收現(xiàn)象,出現(xiàn)這種原因可能是“肝膽循環(huán)”所致。與本實驗中藥餌給藥肝胰臟中藥物濃度高的相關報道有,美洲龍蝦血竇內(nèi)注射[11-13],美洲龍蝦[13]和凡納濱對蝦口服OM P[14],均表現(xiàn)出肝胰臟中藥物濃度高出其他組織的幾十倍甚至上百倍。

藥浴給藥方式下,檢測到各組織中都有諾氟沙星大量存在,推測諾氟沙星可經(jīng)鰓吸收。鰓是中國對蝦進行氣體交換的場所,具有豐富的毛細血管。當藥物經(jīng)鰓進入對蝦體內(nèi)后,隨著血液循環(huán)進入其他組織和器官。對于鰓對物質的吸收現(xiàn)象,其他文獻也有報道。劉長發(fā)研究報道了金魚鰓對鉛和鎘的吸收過程,研究結果表明當鉛或鎘顆粒隨水流經(jīng)過鰓表面時,部分水鋁礦顆粒吸附在鰓絲表面黏液上,鉛或鎘以載體轉運方式進入鰓組織,再轉移到血液[15-16]。藥物經(jīng)鰓進入對蝦體內(nèi),經(jīng)過血液循環(huán)進入肝胰腺,對蝦肝胰臟中的藥物濃度在9 h時才達高峰,因此藥浴給藥方式下肝胰腺中藥物達峰時間比藥餌給藥方式下滯后。

3.2 諾氟沙星在中國對蝦組織中的殘留及消除規(guī)律

諾氟沙星在中國對蝦體內(nèi)經(jīng)藥浴給藥和藥餌給藥后,組織中的藥物濃度顯著高于血液中的濃度。而肝胰腺不僅是水產(chǎn)動物的解毒器官又是排泄器官,所以成為水生生物體內(nèi)漁藥殘留的主要部位[17-18]。藥浴給藥方式下,肝臟與血液中的藥物濃度比最高值可達10.45∶1;藥餌給藥方式下,肝臟與血液中的藥物濃度比最高值為7.2∶1,說明該藥物在體內(nèi)的穿透力極強,廣泛分布于各組織中。組織中的藥物濃度較高,可用于全身及深部組織感染的治療。水產(chǎn)動物的種屬[19-20]、性別[21]、水溫[22]、給藥方式[6]、給藥劑量[21-22]都會影響氟喹諾酮類藥物的消除。給藥途徑不同主要影響生物利用度和藥效出現(xiàn)的快慢。Oie S&Tozer T N研究表明,藥物的吸收速度受到給藥途徑的影響,一般由快到慢依次為:靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、口服、藥浴。郭錦朱和廖一久比較了不同給藥方式下帶點石斑魚(Epinephelis)對氟甲奎的吸收、分布和消除發(fā)現(xiàn),藥餌方式給藥生物利用度比藥浴方式高得多,分別為44%和9%。Mal wisi Let等對鯉諾氟沙星藥動學比較研究也指出,諾氟沙星口灌比肌注和混飼吸收程度都要好,混飼給藥吸收速度較慢且生物利用也低。本文研究發(fā)現(xiàn),諾氟沙星藥浴給藥與藥餌給藥相比,在體內(nèi)殘留量大,消除時間長。這種現(xiàn)象可能與對蝦對藥餌沒有完全攝入有關或者藥餌一部分溶于水體,也可能與連續(xù)藥浴時鰓的吸收作用有關;再者就是藥浴給藥劑量是推薦劑量的2.5倍,而藥餌給藥劑量按照推薦劑量給藥,2種給藥方式給藥劑量與推薦劑量相比,藥浴給藥劑量更大。

3.3 2種給藥方式下血藥濃度出現(xiàn)“雙峰”現(xiàn)象

本研究在2種給藥方式下,中國對蝦的血藥-濃度關系曲線出現(xiàn)2個藥物濃度峰,稱為“雙峰”現(xiàn)象。該現(xiàn)象與南美白對蝦[23]、凡納濱對蝦[8]血淋巴的研究結果一致。關于藥物吸收出現(xiàn)雙峰或多峰現(xiàn)象及其機制的研究在兔、鼠等其他動物已有報道[24-25],這可能與肝腸循環(huán)、胃腸循環(huán)、吸收速率等有關[26]。藥物藥-時曲線第二峰的出現(xiàn),相當于一次“自體給藥”的過程,勢必影響藥物作用強度及消除過程[27],但對于產(chǎn)生機理的探討有待繼續(xù)研究。在制定臨床給藥方案時,應注意“雙峰現(xiàn)象”的影響。

3.4 休藥期的制定

目前,歐盟、美國禁止諾氟沙星用于食品動物,我國尚未見禁止NFLX在食品動物中使用的報道。歐盟對氟喹諾酮類藥物(恩諾沙星、環(huán)丙沙星、單諾沙星)在食品動物中MRL的規(guī)定:肌肉組織中為100μg·kg-1,肝臟和腎臟組織中為200μg·kg-1,在有關家禽及豬組織中NFLX的MRL為:50μg·kg-1,NFLX在水產(chǎn)品中的M RL尚未確定,因此本實驗中NFLX的M RL暫以50μg·kg-1為標準。在溫度(28±1)℃條件下,中國對蝦經(jīng)藥餌給藥(30mg·kg-1)和藥浴給藥(10mg·L-1)后,要想降到50μg·kg-1的殘留限量,NFLX在對蝦肌肉中的休藥期分別不得低于(3.90和3.84 d)。由于溫度對藥物殘留的影響非常大,隨著溫度的升高,藥物在水產(chǎn)動物體內(nèi)的代謝速度加快,藥物殘留量低。Ellis A E等研究表明,溫度升高1℃,藥物代謝速度增加10%。由于藥物在動物體內(nèi)的消除受許多因素的影響,因此關于休藥期的制定應多方面考慮。本實驗條件下所制定的休藥期適應于本實驗的條件,當條件有所區(qū)別時,本休藥期僅作參考。

[1] 郭惠元.我國諾酮類抗菌藥物研究開發(fā)概況[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1989,20(9):421-424.

[2] Vancutsem P,Babish J G,Scward W S.The fluoroquinolones antimicrobial:struettire,antimicrobial animals and toxicity[J].Cornell Vet,1990,80(2):173-186.

[3] 楊先樂,王民權,楊勇.諾氟沙星在大黃魚血漿和肌肉中的RPHPLC檢測方法[J].水產(chǎn)學報,2004,28(12):1-6.

[4] 何平,尹文林,沈錦玉,等.諾氟沙星在淡水青蝦體內(nèi)藥物代謝動力學研究[J].浙江海洋學院學報,2008,27(2):135-139.

[5] 陳文銀,印春華.諾氟沙星在中華鱉體內(nèi)的藥代動力學研究[J].水產(chǎn)學報,1997,21(4):434-437.

[6] 張雅斌,張祚新,鄭偉,等.不同給藥方式下鯉對諾氟沙星的藥代動力學研究[J].水產(chǎn)學報,2000,24(6):559-563.

[7] 房文紅,邵錦華,施兆鴻,等.斑節(jié)對蝦血淋巴中諾氟沙星含量測定及藥代動力學[J].水生生物學報,2003,27(1):13-17.

[8] 房文紅,楊先樂,周凱.諾氟沙星在凡納濱對蝦不同組織中處置和消除規(guī)律[J].水產(chǎn)學報,2004,28(增刊):19-24.

[9] 劉玉林,王翔凌,楊先樂,等.諾氟沙星在大黃魚體內(nèi)的藥代動力學及殘留研究[J].水產(chǎn)學報,2007,31(5):655-660.

[10] 林志彬,金有豫.醫(yī)用藥理學基礎[M].北京:世界圖書出版公司,1998:4-18.

[11] Barron M G,Gedutis C,James M O.Pharmacokinetics of sulphadimethoxine in the lobster,Homerus americannus,following intrapericardial administration[J].Xenobiotica,1988,18(3):269-277.

[12] James M O,Barron M G.Disposition of sulfadimethoxine in the lobster(Homarus americanus)[J].Vet Hum Toxicol,1988,30(suppl):36-40.

[13] James M O,Herbert A H.Disposition of ormetop rim in the lobster,Homarus americanus[J].Pharm Res,1988(5):196-203.

[14] Park E D,Lightner D V,Milner N,et al.Exp loratoxy bioavailability and pharmacokinetic studier of sulphadimethoxine and ormetop rim in the penacid shrimp,Penaeus tannamei[J].Aquac;1995,130(2,3):113-128.

[15] 劉長發(fā),陶澍,曹軍,等.金魚鰓對顆粒吸附態(tài)鉛的吸收[J].應用生態(tài)學報,2000,11(2):283-286.

[16] 劉長發(fā),陶澍,龍愛民.金魚對顆粒態(tài)鎘的鰓吸收[J].環(huán)境科學學報,2001,21(1):24-28.

[17] 李美同,郭文林,仲鋒.土霉素在鰻鱺組織中殘留的消除規(guī)律[J].水產(chǎn)學報,1997,21(1):39-43.

[18] 朱秋華,錢國英.3種藥物在甲魚體內(nèi)的殘留研究[J].中國水產(chǎn)科學,2001,8(1):50-53.

[19] 楊先樂,劉至治,恒山雅仁.鹽酸環(huán)丙沙星在中華絨鰲蟹體內(nèi)藥物代謝動力學研究[J].水生生物學報,2003,27(1):18-21.

[20] 方星星,李健,王群,等.復方新諾明在花鱸體內(nèi)的殘留及消除規(guī)律[J].海洋科學,2003,27(9):16-20.

[21] Ho S P,Cheng C F,Wang W S.Pharmacokinetic and depletion studies of sarafloxacin after oral administration to eel(Anguilla anguilla)[J].Journal of Veterinary Medical Science,1999,61(5):459-463.

[22] Martinsen B,Horsberg T E,Bruke M.M ultiple-dose pharmacokinetic and depletion studies of sarafloxacin in Atlantic salmon(salmo salar)[J].Journal of Fish Diseases,1994,17(2):111-121.

[23] 房文紅,鄭國興.肌注和藥餌給藥下諾氟沙星在南美白對蝦血淋巴中藥代動力學[J].水生生物學報,2006,30(5):541-546.

[24] 周懷梧,沈佳慶,呂明,等.吡羅昔康在家兔體內(nèi)的腸肝藥物動力學分析[J].中國藥理學報,1992,13(2):180-182.

[25] 陳淑娟,楊毅梅,劉奕明,等.蝙蝠葛堿大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學研究[J].中國藥理學通報,2001,17(2):225-229.

[26] 顧培德.阿斯匹林血藥濃度雙峰現(xiàn)象初探[J].蘇州醫(yī)學院學報,1996,16(1):44.

[27] 林武,梁文權,趙偉紅,等.炎痛喜康藥物動力學的雙峰現(xiàn)象[J].浙江醫(yī)科大學學報,1991,20(4):150-152.