仿刺參生殖腺發(fā)生與早期分化的組織學觀察*

晏 萌,隋 娟,邵明瑜,胡景杰,張志峰**

(1.中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室,山東青島266003;2.中國科學院海洋研究所,山東青島266003)

生殖腺由生殖細胞與體細胞共同形成,是配子形成的部位。對生殖腺的研究是遺傳學、生殖生物學以及進化生物學等學科的重要內(nèi)容之一。生殖腺常伴隨著個體發(fā)生和性成熟過程而產(chǎn)生和分化,對生殖腺發(fā)生和分化的認識可以為人們更好地掌握該物種的生殖腺特性、人工繁育以及進一步地生殖調(diào)控、提高種質(zhì)質(zhì)量等等提供有用的基礎數(shù)據(jù)[1]。

對于海參生殖腺的研究,目前已在組織學結(jié)構(gòu)[2-3]、生殖腺發(fā)育周期[4-5]、生理生化[6]等方面有了一些報道。已知海參的生殖腺呈分枝管狀,生殖腺管表面覆蓋一層上皮細胞,其管壁細胞向內(nèi)側(cè)突出,形成褶皺。根據(jù)組織學特征,刺參生殖腺被劃分為5個時期。Jennifer曾對海參(Synaptu la hydriform is)的原始生殖細胞及其分化進行了超微結(jié)構(gòu)的觀察[7],然而有關(guān)海參綱動物生殖腺的發(fā)生和分化,迄今未見報道。

仿刺參(A postichopus japonicus Selenka)是海參綱中具有最高營養(yǎng)價值的經(jīng)濟種類之一,近年來對其生物學特征以及繁殖生物學等領(lǐng)域有了較廣泛的研究[8-9]。本研究運用組織學手段,開展其生殖腺的發(fā)生和早期分化的研究,旨在為深入研究仿刺參生殖生物學特性和生殖調(diào)控等提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體長為0.1～3 cm的稚、幼參與3～5 cm的幼參分別于2007年7月和2008年12月取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院。

1.2 材料處理

使用飽和MgSO4對各期稚、幼參進行麻醉,待其口觸手與身體充分伸展后,以游標卡尺測量其體長(頭部石灰環(huán)至尾部的距離)[10],然后投入Bouin’s液中固定12～16 h(根據(jù)個體大小),固定期間于體壁處剪開若干小口,以便于固定液及時滲入。

1.3 組織學觀察

體長0.1 cm的稚參采用瓊脂-石蠟雙重包埋,其他樣品均采用石蠟包埋。Histostart 820型切片機(Reichert)上進行連續(xù)切片,厚度為5μm,H.E.染色,Nikon 80i顯微鏡下觀察,使用N IS-Elements軟件拍照并測量細胞直徑(取切面中細胞邊緣最大距離作為直徑,n=5)。

2 結(jié)果

2.1 仿刺參生殖腺的發(fā)生部位

體長0.1 cm稚參體前部的背腸系膜(石管后方、消化管前端處的背側(cè)腸系膜)中,可見原生殖細胞(Primordial germ cells,PGCs)分布。連續(xù)切片觀察,此期PGCs數(shù)量約10個,夾雜于背腸系膜的結(jié)締組織細胞之間,并與該處結(jié)締組織共同構(gòu)成仿刺參的原始性腺(Original gonad)或稱為未分化性腺(Undifferentiated gonad)(見圖版1-A,B)。顯微鏡下,原始生殖細胞直徑為(3±0.17)μm,明顯大于周圍結(jié)締組織細胞,其細胞核大而圓,核基質(zhì)較透明,核仁明顯,細胞質(zhì)呈現(xiàn)弱嗜堿性,具有典型PGCs的形態(tài)特征(見圖版1-B)。

2.2 仿刺參生殖腺早期發(fā)育的組織學特征

體長0.3 cm的稚參,原始性腺較前期稍有加長,其中生殖細胞數(shù)量增至40個左右,邊緣的生殖細胞較中央的排列更緊密(見圖版1-C),且前者的體積小于后者。體長0.4 cm的稚參中,原始生殖腺進一步拉長,性腺中出現(xiàn)狹窄腔隙(見圖版1-D)。當稚參體長達到0.5 cm時,原始生殖腺中央產(chǎn)生1個明顯的空腔結(jié)構(gòu),生殖腺初具雛形。此時位于生殖腺管壁最外層的細胞排列成上皮樣,腔的周圍由生殖干細胞和生殖腺體細胞包圍(見圖版1-E)。1 cm長的幼參,其生殖腺管腔擴大,局部管壁中生殖細胞排列成2層(見圖版1-F)。2 cm體長的幼參與體長0.5 cm的稚參相比,其生殖腺管腔明顯擴大,局部管壁中的生殖細胞出現(xiàn)3層(見圖版1-G)。此階段生殖細胞的形態(tài)未見明顯變化。

圖版1 仿刺參生殖腺發(fā)生與早期分化Plate 1 Genesis and early differentiation of gonad in A.japonicus

體長3 cm幼參的生殖腺出現(xiàn)二分枝管狀結(jié)構(gòu),每個腺管的管壁外層為排列緊密的單層上皮樣細胞,內(nèi)側(cè)由多層生殖細胞構(gòu)成(見圖版1-Ⅰ),較貼近上皮樣細胞的生殖細胞直徑較大,可達到(4±0.72)μm。生殖細胞數(shù)量超過600個,生殖腺的基本結(jié)構(gòu)已經(jīng)具備。

體長3.5 cm幼參生殖腺中的生殖細胞仍較均勻分布,生殖管壁外層上皮樣細胞排列更加緊密(見圖版1-J)。4 cm長幼參的生殖腺中可見多分枝結(jié)構(gòu),在生殖腺的縱切面可見多個生殖腺管結(jié)構(gòu),并且在部分管腔內(nèi)含生殖細胞的管壁的內(nèi)層細胞向內(nèi)發(fā)生褶皺,形成以生殖細胞為主的嵴狀突起(見圖版1-K),隨著發(fā)育的進行,在體長5.3 cm的幼參生殖腺中生殖腺管腔內(nèi)側(cè)的嵴狀突起更加密集(見圖版1-L)。

3 討論

3.1 仿刺參生殖腺發(fā)生的時空特征

Jennifer等報道[7],海參S.hydriform is的生殖腺最早在剛變態(tài)的稚參(體長約0.1 cm)中臨近石管和環(huán)水管的背腸系膜處發(fā)現(xiàn)。本研究中,在體長為0.1 cm的仿刺參A.japonicus稚參的背腸系膜前端的位置出現(xiàn)由約10個原始生殖細胞形成的原始性腺。該結(jié)果與隋娟等報道的在稚參背腸系膜處發(fā)現(xiàn)vasa基因的集中表達的結(jié)果相符[11]。隨著仿刺參體長的增長,生殖腺在腸系膜中不斷延伸,然而在其早期發(fā)育過程中其相對位置變化不大,位于咽與胃過度部位的背側(cè)。

生殖腺沿背系膜延伸的現(xiàn)象,在其他棘皮動物中也有發(fā)現(xiàn),M argaret等[12]在對海膽生殖腺發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn):當幼體發(fā)育到體長0.1 cm時,PGCs在原始生殖腺中成簇聚集,在直徑1.5 mm的海膽中,生殖腺原基已經(jīng)開始在背腸系膜中隨PGCs數(shù)目的增多而加寬加長。在比較海參和海膽的生殖腺發(fā)生,發(fā)現(xiàn)二者的模式基本一致,即生殖腺的發(fā)生均為背腸系膜處,并且隨著PGCs在其中增殖,生殖腺也在腸系膜中延伸。

3.2 仿刺參生殖腺發(fā)生的形態(tài)特征

仿刺參的生殖腺發(fā)生特點是先出現(xiàn)管腔,管腔不斷加寬拉長,隨后發(fā)生分枝。稚參體長達到0.3 cm時,原始生殖腺出現(xiàn)中央細胞排列松散的現(xiàn)象,在體長達到0.4 cm時,兩端出現(xiàn)明顯的腔隙,此時為生殖腺管腔形成的前期。稚參體長達到0.5 cm時,生殖腺中心處管腔擴大,發(fā)育至體長2 cm時,生殖腺管端部也發(fā)生擴大,形成膨大的立方體腔。幼參在體長3 cm時,生殖腺管出現(xiàn)二分枝,隨著體長的增長,出現(xiàn)多重分枝。隋錫林等報道的成熟仿刺參,生殖腺呈多分枝狀于腸系膜的兩側(cè),可推測在體長達到5.3 cm之后,仿刺參幼體的生殖腺將會不斷分枝拉長,對稱地分布在背腸系膜兩側(cè)。

Jennifer對海參S.hydriform is幼體生殖腺的研究中發(fā)現(xiàn),體長0.1 cm時,稚參的生殖腺已經(jīng)由3層細胞構(gòu)成且出現(xiàn)腔結(jié)構(gòu)。M argerat的海膽實驗中也發(fā)現(xiàn)了生殖腺變形與分枝的現(xiàn)象,從體長2 mm開始,海膽的PGCs延背系膜向兩側(cè)遷移,形成T形結(jié)構(gòu),5 mm的海膽中,生殖腺出現(xiàn)分枝。可見海參和海膽生殖腺的發(fā)育多存在先出現(xiàn)管腔再分枝變形的特點。

本研究中,稚參體長達到0.3 cm時,可見原始生殖腺體細胞增殖,緊密地排列在生殖細胞周圍,當仿刺參生殖腺出現(xiàn)分枝后,生殖上皮的細胞分化更為明顯,主要可分為2層,內(nèi)層為排列較松散的生殖細胞,外層為排列緊密的較小的上皮樣細胞。而海參S.hydriform is中,體細胞包圍PGCs的時間似乎早于仿刺參,即在0.1 cm體長時,其生殖上皮的體細胞便形成了包圍PGCs的不完整的細胞層;超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),S.hyd riform is生殖上皮外層有腹膜包被,腹膜與生殖上皮之間存在結(jié)締組織;生殖上皮中生殖細胞是1種上皮樣帶鞭毛的領(lǐng)細胞,其中的體細胞形態(tài)不規(guī)則;盡管其生殖上皮細胞結(jié)構(gòu)獨特而復雜,但是其仍表現(xiàn)出典型的無脊椎動物性腺上皮細胞的所有特性[7]。

3.3 仿刺參生殖腺的性別分化

本實驗中,幼參體長4 cm時,生殖腺的部分管壁內(nèi)層細胞向內(nèi)發(fā)生褶皺,形成以生殖細胞為主的嵴狀突起,隨著發(fā)育的進行,生殖腺管腔內(nèi)側(cè)的嵴狀突起更加密集。常亞青等[13]報道,成體仿刺參精巢在增殖期起始階段,其生殖上皮增長顯著,向管腔內(nèi)延伸,并于其中形成大小不一的褶皺;而在同時期的卵巢橫切面中,隨生殖上皮的生長,其在生殖管內(nèi)形成大小不一的梅花瓣狀褶皺。根據(jù)本實驗對5.3 cm幼參的生殖腺橫切面觀察,某些個體的生殖腺管腔內(nèi)有嵴狀褶皺,而另外一些個體則無明顯的褶皺。據(jù)此作者推測實驗中生殖腺出現(xiàn)褶皺的個體可能為雄性。

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