少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株絲氨酸蛋白酶全長基因的克隆及生物信息學(xué)分析

王俊偉，孟慶玲，喬軍，王為升，羅建勛，才學(xué)鵬，趙春光

（1石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子832003；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州730046）

少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株絲氨酸蛋白酶全長基因的克隆及生物信息學(xué)分析

王俊偉1，孟慶玲1，喬軍1，王為升1，羅建勛2，才學(xué)鵬2，趙春光1

（1石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子832003；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州730046）

根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR技術(shù)對少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株（XJ－XA）絲氨酸蛋白酶（命名為Aoz1）基因序列進(jìn)行了擴(kuò)增，并與國內(nèi)外少孢節(jié)叢孢菌不同地域分離株相應(yīng)序列進(jìn)行了同源性分析，構(gòu)建該基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，XJ－XA Aoz1基因全長為1344bp，包含2個(gè)外顯子和1個(gè)63bp的內(nèi)含子（第517～579位核苷酸），編碼426個(gè)氨基酸。Aoz1的信號肽位于氨基酸序列的第1～21位氨基酸；氨基酸序列的第160～171位、200～210位和351～361位分別是天冬氨酸（D）、組氨酸（H）和絲氨酸（S）活性位點(diǎn)所在區(qū)域，表明該酶屬于Subtilase家族；該酶還含有2個(gè)潛在的N末端糖基化位點(diǎn)及2個(gè)與底物結(jié)合的S1區(qū)。系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，少孢節(jié)叢孢菌不同地域分離株Aoz1基因序列具有較高的親緣性，與其他捕食線蟲性真菌Aoz1基因親緣性較遠(yuǎn)。本研究為研發(fā)家畜線蟲病生物防控制劑奠定了前期基礎(chǔ)。

少孢節(jié)叢孢菌；絲氨酸蛋白酶；基因克??；生物信息學(xué)

捕食線蟲性真菌是殺線蟲性真菌中的一類以營養(yǎng)菌絲特化形成的捕食器（黏性菌絲、粘性菌網(wǎng)、黏性分枝、黏性球、收縮環(huán)、非收縮環(huán)和冠囊體等）捕捉線蟲的真菌［1－2］，主要包括節(jié)叢孢屬（Arthrobotrys Corda）、隔指孢屬（Dactylella Grove）和單頂孢屬（MonacrosporiumOudermans）等種類。近幾十年來，丹麥等國開展用捕食線蟲性真菌對動物寄生蟲病進(jìn)行生物防控的研究，篩選出了適合本國實(shí)際作用良好的菌株，并在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行了殺滅寄生性線蟲的試驗(yàn)，取得了理想的效果。其中，丹麥已申報(bào)了國際專利，并進(jìn)行了商品化開發(fā)與推廣試驗(yàn)研究。

近年來，人們對真菌捕食線蟲的分子機(jī)制有了較深入研究，先后發(fā)現(xiàn)并克隆了一些真菌侵染線蟲的相關(guān)基因［3－6］，這為研發(fā)預(yù)防動物消化道線蟲的生物防控制劑奠定了一定的基礎(chǔ)［7－9］。新疆的微生物資源豐富，某特有的生態(tài)環(huán)境使得一些微生物具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。本研究在分離多株具有強(qiáng)捕食線蟲活性真菌的研究基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)對少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株絲氨酸蛋白酶（Aoz1）的編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測序，通過分子生物學(xué)軟件對不同種類真菌的Aoz1基因序列進(jìn)行比較分析，了解該基因在不同種屬菌株間的同源性和相關(guān)分子信息，旨在為下一步進(jìn)行該功能性基因的異種表達(dá)和對少孢節(jié)叢孢菌重組菌構(gòu)建奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

捕食線蟲性真菌－少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株（Arthrobotrys oligospora XJ－XA）由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。GPYA培養(yǎng)基由本研究室自配（15g葡萄糖，2g蛋白胨，5g酵母提取物，加蒸餾水定容至1L）。Taq plus DNA聚合酶、dNTPs、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自上海生物工程公司，pMD18－T載體和200bp DNA Ladder Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的提取

將少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株（Arthrobotrys oligospora XJ－XA）接種于GPYA培養(yǎng)基中，在20±1℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。取適量的菌絲，然后按照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行提取少孢節(jié)叢孢菌的DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的相關(guān)基因序列，采用Premier 5.0引物軟件設(shè)計(jì)少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶編碼序列的特異性引物：

上游引物 Aoz1－f：5′－ATGCTTACGAACGGCCTCATCTC－3′；

下 游 引 物 Aoz1－r：5′－CTAGCTAGCAACAATCGCGACTTGGTG－3′。

引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。將合成的引物進(jìn)行低溫瞬時(shí)離心，加入滅菌三蒸水配成100 μm儲備液，于－20℃保存，使用時(shí)稀釋為25μm。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件

總反應(yīng)體系為50μL，體系成分：取提取的DNA模板 2μL，10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol／L dNTPs 4μL，Aoz1－f（25μm／L）、Aoz1－r（25μm／L）各1μL，d3H2O 36.8μL，Taq DNA聚合酶（5U／μL）0.2 μL混勻。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性40 s，54℃退火40s，72℃延伸150s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。最后降溫至4℃保存。

1.2.4 Aoz1基因的克隆

將PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，并設(shè)Marker和陰性對照，以檢測其純度及堿基序列長度。電泳完成后，小心取出膠板，置于電泳凝膠紫外成像儀中，觀察拍照。對擴(kuò)增得到的PCR粗產(chǎn)物再用回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將純化回收片段和載體pMDl8－T連接過夜，次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，在氨芐青霉素平板上進(jìn)行篩選，然后做菌落PCR反應(yīng)進(jìn)一步篩選驗(yàn)證。

1.2.5 序列測定與分析

將驗(yàn)證正確的重組載體產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司直接測定核苷酸序列。利用生物在線分析軟件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／，http：／／www.expasy.org／tools／）對絲氨酸蛋白酶Aoz1中存在的信號肽、結(jié)構(gòu)域、氨基酸活性位點(diǎn)等進(jìn)行分析，并應(yīng)用MEGA5.0等軟件對新疆分離株和GenBank中發(fā)表的捕食線蟲性真菌及相關(guān)菌株的絲氨酸蛋白酶基因序列進(jìn)行分析，并采用NJ法（Neighbor－Joining Method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用特異性引物擴(kuò)增出Aoz1基因序列，再經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所擴(kuò)增的目的PCR產(chǎn)物的分子量約1344bp（圖1）。克隆轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑取單菌落，做菌液PCR篩選驗(yàn)證，成功得到陽性轉(zhuǎn)化子（圖2）。

圖1 絲氨酸蛋白酶Aoz1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1Amplification product test results of serine protease Aoz1gene by PCR

圖2 絲氨酸蛋白酶Aoz1基因陽性克隆菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2Amplification product test results of positive transformants of serine protease Aoz1gene of Arthrobotrys oligospora XJ－XA by colony PCR

2.2 絲氨酸蛋白酶基因核苷酸及氨基酸序列生物信息學(xué)分析

經(jīng)測序，Aoz1基因全長1344bp（此序列已經(jīng)提交GenBank，登錄號為JF747254），該序列由1個(gè)開放閱讀框（ORF）組成，含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。內(nèi)含子位于Aoz1基因的第517～579位核苷酸，大小為63bp，以GT開頭，AG結(jié)尾，具有真菌內(nèi)含子的共同特征。用DNAMAN軟件翻譯所得序列編碼區(qū)得到蛋白質(zhì)氨基酸序列（圖3）。

圖3 少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶基因和氨基酸序列Fig.3Nucleotide sequence and amino acids sequence of serine protease of Arthrobotrys oligospora

由圖3可知，序列中含有426個(gè)氨基酸；進(jìn)一步經(jīng)同源性分析得知：翻譯后氨基酸序列與GenBank中發(fā)表的少孢節(jié)叢孢菌的PII蛋白酶的氨基酸序列同源性為97.67%，與少孢節(jié)叢孢菌中性絲氨酸蛋白酶氨基酸序列的同源性為97.89%。與其他蛋白酶同源性比對顯示，Aoz1為典型的絲氨酸蛋白酶。Aoz1絲氨酸蛋白酶含有的信號肽位于序列的第1～21位，包含起始密碼子甲硫氨酸（M）、1個(gè)由8個(gè)氨基酸殘基（Leu－Leu－Ala－Ile－Ala－Gly－Leu－Ala）組成的疏水中心以及在信號肽酶酶切位點(diǎn)之前的3個(gè)疏水殘基（Ala－Phe－Ala）。Aoz1前肽切割位點(diǎn)在分泌性蛋白的N末端之前，且前肽的最后1個(gè)氨基酸殘基是位于序列第123位的酪氨酸（Y）；氨基酸序列的第160～171位、200～210位、351～361位分別是天冬氨酸（D）、組氨酸（H）、絲氨酸（S）活性位點(diǎn)所在區(qū)域，表明該酶屬于Subtilase家族。成熟的Aoz1絲氨酸蛋白酶序列包括303個(gè)氨基酸，分子量為31.4kDa，分子式為C1364H2129N389O454S6，等電點(diǎn)理論值為5.97；它還包括2個(gè)潛在的N末端糖基化位點(diǎn)（Asn178、Asn252）及與底物結(jié)合的S1區(qū)（SBP）Ser259Leu260Gly261和 Ala285Ala286Gly287（圖4）；而且高度保守的Asn288在維持反應(yīng)中間物的穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵性作用。

圖4 Aoz1基因的內(nèi)含子／外顯子和基本特征的模式圖Fig.4Diagram of Aoz1gene showing the presence of intron／exons and basic features

2.3 少孢節(jié)叢孢菌XJ－XA株絲氨酸蛋白酶Aoz1的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA在線軟件對少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ－XA的絲氨酸蛋白酶Aoz1進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖5）。預(yù)測Aoz1蛋白的二級結(jié)構(gòu)包括426個(gè)氨基酸，其中115個(gè)氨基酸（占27.00%）可能形成α－螺旋（h），95個(gè)氨基酸（占22.3%）可能形成延伸鏈（e），189個(gè)氨基酸（占44.37%）可能形成無規(guī)卷曲（c），27個(gè)氨基酸（占6.34%）可能形成β－轉(zhuǎn)角（t），但沒有形成β－折疊片。由此可知該蛋白質(zhì)主要以α－螺旋、延伸鏈及無規(guī)卷曲為主。

圖5 利用SOPMA在線軟件預(yù)測的少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ－XA絲氨酸蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)Fig.5Predicted secondery structure of serine protease Aoz1of A.oligospora XJ－XA by using SOPMA secondary structure prediction method

2.4 少孢節(jié)叢孢菌XJ－XA株與世界不同地域分離株同源性比較

用DNAStar中的Clustal V軟件對測序所得的少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ－XA絲氨酸蛋白酶基因序列與GenBank中發(fā)表的絲氨酸蛋白酶基因編碼序列進(jìn)行分析，少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株（A.oligospora XJ－XA）絲氨酸蛋白酶基因序列與A.oligospora國外株絲氨酸蛋白酶基因、A.oligospora中性絲氨酸蛋白酶基因、A.multisecundaria絲氨酸蛋白酶基因、彎孢節(jié)叢孢菌（A.musiformis）絲氨酸蛋白酶基因、云南節(jié)叢孢菌（A.yunnanensis）絲氨酸蛋白酶基因的相似性分別為97.5%、98.3%、76.8%、81.9%和74.6%；同時(shí)發(fā)現(xiàn)屬內(nèi)種間和種內(nèi)株間相似性相差較大。

2.5 少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶基因的遺傳進(jìn)化分析

借助MEGA5.0軟件包對新疆分離株（XJ－XA）和GenBank中發(fā)表的其他捕食線蟲性真菌及相關(guān)菌株的絲氨酸蛋白酶基因序列繪制了進(jìn)化樹（圖6）。從進(jìn)化樹圖上可以看出：來源于食線蟲性真菌和昆蟲病原真菌的絲氨酸蛋白酶聚成2個(gè)分枝，由共同祖先進(jìn)化而來。來自捕食線蟲性真菌的絲氨酸蛋白酶（XJ－XA Aoz1、Mc1、Aoz1、Ac1、Dv1、Ds1、Mlx、PII和SPR1等）較有規(guī)律的按捕食結(jié)構(gòu)的不同排列于進(jìn)化樹上并形成第一個(gè)分枝；來自內(nèi)寄生性真菌和昆蟲病原性真菌的絲氨酸蛋白酶（Pr1、PrA、PrK、Psp－3、VCP1和 Ver112）也依次分別較早地聚于一起并形成第二個(gè)分枝。但值得注意的是，Monacrosporium haptotylumSPR2經(jīng)核苷酸序列比對存在幾個(gè)較大堿基變異區(qū)，變異程度較大，在進(jìn)化樹上單獨(dú)形成第三個(gè)分枝，其分類還有待商榷。在進(jìn)化樹圖上，XJ－XA與A.oligospora國外株、A.oligospora云南分離株較早地聚為一枝，親緣關(guān)系最近，而與隔指孢屬和單頂孢屬在遺傳距離上相對較遠(yuǎn)，符合根據(jù)捕食器結(jié)構(gòu)和分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行分類的結(jié)果，也說明基于功能性基因的分子生物學(xué)信息可以在一定程度上反映捕食線蟲性真菌的分類關(guān)系，但功能性基因能否作為分類的依據(jù)還有待商榷。

圖6 采用NJ法基于Aoz1基因所做的捕食線蟲性真菌的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.6Phylogenetic analysis of nematode－trapping fungi based on Aoz1gene with Neighbor－Joining（NJ）Method

3 討論

根據(jù)捕食器類型，捕食線蟲性真菌分成兩種，一種是套捕型捕食線蟲性真菌，代表種為少孢節(jié)叢孢菌（Arthrobotrys oligospora），可產(chǎn)生菌環(huán)、粘性菌網(wǎng)等捕食器，以套捕方式捕食線蟲幼蟲。另一種是粘捕型捕食線蟲性真菌，代表種為紡錘隔指孢菌（Dactylella ellipsospora），可形成菌結(jié)等捕食器，以粘捕的方式捕食線蟲幼蟲［10－11］。捕食線蟲性真菌的捕食過程可分為吸引、識別和黏附、侵染、消解幾個(gè)過程［11－12］。捕食線蟲性真菌在捕食線蟲時(shí)，首先在線蟲誘導(dǎo)下形成捕食器，捕食器再吸引寄主線蟲并與線蟲發(fā)生特異性識別，進(jìn)而將線蟲粘著，然后在較短時(shí)間內(nèi)侵入線蟲，并于侵入后萌發(fā)產(chǎn)生普通營養(yǎng)菌絲，同時(shí)分泌一些水解酶－－胞外酶，尤其枯草桿菌蛋白酶（Subtilisin）樣絲氨酸蛋白酶，最終將線蟲消解。在侵染線蟲過程中，捕食線蟲性真菌借助機(jī)械壓力和分泌的胞外酶的聯(lián)合作用［13］，促進(jìn)菌絲對線蟲體壁的直接穿透，而其中胞外酶起主導(dǎo)作用。在胞外酶中，Subtilisin樣絲氨酸蛋白酶是一種作為毒力因子的酶類，以具有天冬氨酸（D）－組氨酸（H）－絲氨酸（S）催化三聯(lián)體為特征，是許多真菌侵染線蟲的一種關(guān)鍵酶［12－13］。

在本研究中，少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株絲氨酸蛋白酶核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列與同種國外株和云南分離株的相似性分別為97.67%和97.89%，證實(shí)我們的分離株確實(shí)屬于少孢節(jié)叢孢菌（A.oligospora），擴(kuò)增所得的核苷酸序列為少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶的基因序列。本次試驗(yàn)擴(kuò)增所得的少孢節(jié)叢孢菌XJ－XA株絲氨酸蛋白酶基因序列為1344bp，與同種國外分離株和云南分離株的同源性分別為97.5%和98.3%。系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，少孢節(jié)叢孢菌（A.oligospora）新疆分離株 XJ－XA絲氨酸蛋白酶基因和瑞典株及云南分離株3株菌聚為一枝，與隔指孢屬和單頂孢屬在遺傳距離上相對較遠(yuǎn)，這與基于捕食器結(jié)構(gòu)和分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行分類的結(jié)果相一致。研究還發(fā)現(xiàn)，少孢節(jié)叢孢菌不同分離株絲氨酸蛋白酶之間存在差異，說明少孢節(jié)叢孢菌在不同國家和地區(qū)存在不同的株，其生物學(xué)特性可能也存在差異。

動物線蟲病是嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展的大敵，不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且應(yīng)用化學(xué)驅(qū)蟲藥物已產(chǎn)生抗藥性、藥物殘留對人體的危害和生態(tài)環(huán)境污染等應(yīng)給予高度重視的問題。因此，研發(fā)捕食線蟲性真菌及其侵染線蟲的生物制劑來控制家畜的線蟲病具有重要的意義［14－15］。

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Cloning and Bioinformatics Analysis of Full－Length Gene of Serine Protease of Arthrobotrys oligospora Xinjiang Isolate

WANG Junwei1，MENG Qingling1，QIAO Jun1，WANG Weisheng1，LUO Jianxun2，CAI Xuepeng2，ZHAO Chunguang1
（1Department of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046，China）

According to the previously reported sequences of serine protease of Arthrobotrys oligospora，the serine protease（designated Aoz1）sequence of A.oligospora Xinjiang isolate（XJ－XA）was amplified with designed specific primers by PCR and a phylogenetic tree was constructed corresponding to sequence identity analyses of domestic and overseas isolates of Arthrobotrys oligosporafrom different geographic regions.The results showed that the Aoz1gene of XJ－XA strain contains 1344base pairs with one intron of 63－bp and two exons encoding apolypeptide of 426amino acid residues.Aoz1has a signal peptide of 21－amino acid consisting of the initial methionine，position 1～21in Aoz1，and the protease had the aspartic acid （Asp164）－h(huán)istidine（His203）－serine（Ser353）（in Aoz1）catalytic triad as active sites，which confirmed that Aoz1belongs to the subtilisin－like serine protease family.Moreover，Aoz1contains two potential N－linked glycosylation sites and two substrate－binding S1pockets.Phylogenetic analyses revealed that the sequences of A.oligosporaisolates from different geographic regions had a high degree of sequence identities and diverged from sequences of the proteases isolated from other nematode－trapping fungi.The present study can lay agood foundation for the preparation of biological agents in the control of gastrointestinal nematodes of domestic.

Arthrobotrys oligospora；serine protease；gene cloning；bioinformatics

S852.659.5

A

1007－7383（2011）06－0700－06

2011－09－13

新疆兵團(tuán)博士資金項(xiàng)目（2009JC09），石河子大學(xué)高層次人才專項(xiàng)（RCZX200901）

王俊偉（1985－），男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)榉肿蛹纳x學(xué)；e－mail：13649996897＠163.com。

孟慶玲（1969－），女，副教授，博士，從事寄生蟲分子生物學(xué)研究；e－mail：xjmqlqj＠163.com。